MVA病毒儲液制備實驗——免疫染色法滴度測定

MVA 病毒滴度通常是用免疫染色法進行測定，因為 MVA 不能在 CEF 或 BHK-21 細胞中形成噬斑。

CEF 或 BHK-21 細胞MVA病毒儲液

MEM-10 和 MEM-2.5 完全培養基1:1 丙酮／甲醇PBS（含和不含3% FBS兩種）PBS／H2O2兔抗痘苗病毒抗體辣根過氧化物酶偶聯的抗兔 Ig 抗體

過氧化酶底物試劑盒6 孔 35 mm2 組織培養板CO2 培養箱

1. 胰酶消化用 150 cm² 組織培養瓶培養的 CEF 或 BHK-21 細胞（見「細胞培養實驗」基本方案 1 步驟4～6 )，對較大的組織培養瓶用 1.5 ml 胰酶/EDTA 消化。用 5 ml 的完全 MEM-10 培養基重懸細胞，另加入 60 ml 的完全 MEM-10 培養基。

2. 在 6 孔的 35 mm² 組織培養板每孔中加入 2 ml 的細胞懸液，在加濕的 5% CO₂ 培養箱中 37°C 培養過夜至接近單層生長至匯片的程度。

3. 吸出培養基，加入 2 ml 完全 MEM-2.5 培養基。

4. 取出 MVA 病毒儲液，在冰上超聲破碎 30 s。

5. 用完全 MEM-2.5 培養基對病毒進行 8 次 10 倍系列稀釋，注意每次稀釋必須用新的吸管。

6. 用 0.1 ml 10^-6、10^-7、10^-8 病毒稀釋液感染細胞，每個稀釋度感染兩個孔，旋轉混勻，放入 CO₂ 培養箱中 37°C 培養 24 h。

7. 吸出液體，將細胞用 1 ml 1:1: 丙酮/甲醇固定 2 min。吸出固定液，每孔加入 2 ml PBS，立即免疫染色培養板，也可以將培養板在 4°C 存放數周后使用。

8. 用含 3% FBS 的 PBS 稀釋兔抗痘苗病毒抗體，每孔加入 1 ml。室溫溫育 1 h，期間并不時輕輕晃動。

9. 用 2 ml 的 PBS 清洗 2 次。

10. 用含 3% FBS 的 PBS 稀釋辣根過氧化物酶偶聯的抗兔 Ig 抗體，每孔加入 1 ml。室溫溫育30～45 min，期間不時輕輕晃動。

11. 用 2 ml 的 PBS 清洗 2 次。

12. 用 0.5 ml 的乙醇制備鄰聯茴香胺飽和溶液，渦旋混勻，37℃ 下放置 5 min，以最大轉速離心 1 min 澄清溶液，加入 0.2 ml 的鄰聯茴香胺溶液到 10 ml 的PBS/H₂O₂ 中。同樣，也可以按照操作手冊使用底物片劑。

13. 每孔加入 0.5 ml 的鄰聯茴香胺底物溶液，輕輕晃動，放置10 min (弱抗體需要的時間長）。用顯微鏡觀察感染細胞的噬斑，反應完成后，用水洗培養板，并加入 1 ml 的水使其保持濕潤。

14. 對染色的噬斑進行計數，乘以稀釋倍數，得到的滴度表示為感染單位（pfu）/ml。

1. 鄰聯二茴香胺有致癌作用，操作時應該戴手套并在通風櫥中進行。30% H₂O₂對皮膚有腐蝕性，應戴手套操作。

2. 每個抗體的最佳稀釋倍數必須以經驗確定，但最好開始按 1:500 或 1:1000 稀釋。

3. 每孔中有 20～100 個噬斑可以獲得較好的結果。在確定滴度時，應當乘以10，因為每孔只加入了 0.1 ml的病毒量。