MassFrontier碎片離子檢索功能（FISh）在士的寧...（一）

Mass Frontier碎片離子檢索功能（FISh）在士的寧代謝物鑒定中的應用

1.引言

馬錢子為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-Vomical L.的干燥成熟種子, 其主要活性成分是生物堿，具有通經絡、消腫痛、止痛的功效, 是中醫臨床常用藥物。其中主要有效成分士的寧（strychnine）又名番木鱉堿，屬于中樞神經興奮劑，能選擇性興奮脊髓，增強骨骼肌的緊張度，臨床用于偏癱、癱瘓及因注射鏈霉素引起的骨骼肌松弛、弱視癥等和巴比妥類中毒等。但這類成分有劇毒, 作為藥用必須嚴格控制其用量。此外，添加士的寧的飼料誘餌可用來消滅老鼠等嚙齒類有害動物。然而這些動物體內殘留士的寧會通過食物鏈傳遞, 對整個生態圈造成影響。因此有必要建立快速、靈敏、準確的方法檢測該類藥物, 為臨床用藥、環保、司法等部門提供可靠的分析手段和數據。

本文采用高效液相色譜-離子阱靜電場軌道阱高分辨質譜聯用技術對士的寧及其代謝產物進行了全面的分析，利用線性離子阱技術對目標化合物進行MSn多級碎裂，并通過Orbitrap靜電場軌道阱技術獲得一級和多級質譜的高分辨質譜信息。Mass Frontier 7.0結構解析軟件具有豐富的裂解機理數據庫能夠進行準確的碎片歸屬，其獨有的碎片離子檢索（Fragment Ion Search, FISh）功能將母藥和代謝物共有碎片及代謝途徑有機結合到一起，可以檢獲代謝物的全面信息。

2.實驗條件

2.1 液相色譜條件：

儀器：Accela HPLC system液相色譜儀

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil Gold C18 （100×2.1 mm, 1.9 μm）流動相：A為水相：0.05%甲酸 2 mM甲酸銨水溶液，B為有機相：0.05%甲酸 2 mM甲酸銨乙腈溶液

梯度條件：

流速0.2 mL/min，進樣量：5 μL，柱溫為30℃

2.2 質譜條件

儀器：Thermo LTQ Orbitrap XL

質譜離子源參數：ESI Spray voltage：+4.0 KV；Sheath Gas Pressure：35 arb；Aux Gas Pressure： 8 arb；Capillary Temp：275℃； Scan mode：Full MS with data-dependent MSn；CID（collision energy 35%，activation time 30 ms）；Scan range： m/z 200~700。

2.3 樣品制備

按5 mg/kg劑量口服喂食雄性大鼠士的寧，6小時后取大鼠尿樣，SPE固相萃取純化富集，取適量稀釋后進樣分析。

3.結果

3.1代表性組分查找

采用Mass Frontier的聯合組分檢測（Joint Components Detection）算法，對質譜數據中的代表性組分進行查找。基于所有離子輪廓圖最大值的統計分析，通過提取各個質譜峰豐度輪廓圖，可創建出士的寧母藥及其他可能代謝物的“純凈”質譜樹，并生成相應的峰形（圖1）。

圖1. 聯合組分檢測（Joint Components Detection）算法查找代表性組分

3.2士的寧碎片結構解析

在獲得士的寧“純凈”質譜樹后，使用Mass Frontier碎裂數據庫（Fragmentation Library），可快速的對士的寧碎片結構進行歸屬，該數據庫幾乎涵蓋了所有已發表的文獻，所以在快速解析碎片的同時，可獲得完整的碎片裂解途徑，并可方便的調用查看所引用的文獻情況，保證了碎片解析的準確性（圖2）。

圖2. 破裂數據庫（Fragmentation Library）歸屬士的寧碎片及裂解途徑