MolCell：施一公團隊解析人類pretRNA剪接機制

長久以來，剪接體的調控機理是怎樣的，它們在細胞內部的動態組合和變化是怎樣的，深深地吸引著科學家們的研究興趣，但其神秘的面紗一直未被揭開。

2023年4月6日，西湖大學施一公團隊在 Molecular Cell 期刊發表了題為：Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease 的研究論文。

該研究首次解析了人類tRNA剪接內切核酸酶（TSEN）在催化前和催化后狀態下與全長tRNA前體（pre-tRNA）結合的低溫電子顯微鏡結構，顯示了TSEN如何識別pre-tRNA，并將3'剪接位點和5'剪接位點定位到其切割位點，綜合利用結構生物學和生化工作解釋了人類TSEN去除pre-tRNA內含子的分子機制。

轉運RNA（tRNA）對生物遺傳信息的傳遞至關重要，它通過核糖體將mRNA翻譯成蛋白質。成熟的tRNAs由前體tRNAs（pre-tRNAs）通過一系列的轉錄后加工和修飾步驟產生，從pre-tRNA中去除內含子對于生物遺傳進化是必不可少的。

在人類中，去除pre-tRNA中內含子的過程是由tRNA剪接內切核酸酶（TSEN）介導的，該亞酶包括四個亞基：TSEN2、TSEN15、TSEN34 和 TSEN54。值得一提的是，盡管多核苷酸激酶CLP1在體外對前tRNA切割是可有可無的，但CLP1中的突變和所有TSEN亞基都與tRNA代謝和神經病理學的改變有關。

為回答pre-tRNA是如何被TSEN識別的，以及5'剪接位點和3'剪接位點是如何被加載到TSEN2/TSEN34的活性位點這兩個困擾科研界多年的謎題，該研究通過純化人TSEN/CLP1復合物、pre-tRNA切割試驗、TSEN/CLP1/前pre-tRNA復合體的組裝、冷凍電鏡樣品制備和數據采集以及競爭性結合測定生化實驗，對其進行深入探索。

本研究首次報道了兩種人類TSEN與全長pre-tRNA結合、高分辨率低溫電子顯微鏡結構：一種在催化前狀態，另一種在催化后狀態，平均分辨率分別高達2.94?和2.88?。

研究結果顯示人類TSEN的結構特征是一個延伸的表面凹槽，容納了l形的pre-tRNA，pre-tRNA的成熟結構域被TSEN34、TSEN54和TSEN2的保守結構元件所識別，這種識別定位了pre-tRNA的反密碼子莖。

令人驚喜的是，5'剪接位點和3'剪接位點周圍的核苷酸主要被TSEN2和TSEN34識別，這些相互作用可以確保5'剪接位點和3'剪接位點分別精確地放置在TSEN2和TSEN34的催化中心中。

此外，為了捕獲預催化狀態，研究人員在TSEN中引入了兩個錯義突變：TSEN34中的H255A和TSNE2中的H377A，進而研究其結構信息以及結構引導的生化分析，為成功解析人類TSEN前tRNA識別和切割的機制提供了基礎。

考慮到pre-tRNA和tRNA結構的相似性，TSEN延伸的擴展表面凹槽也應該識別tRNA。為證實該分析，tRNAARG-UCU與TSEN/CLP1形成了一個穩定的復合物。與tRNA相比，pre-tRNA可以被TSEN識別，其更具體的相互作用指向其獨特的BHL基序。

上述結果充分地解釋了為什么大部分的內含子序列與TSEN沒有直接的相互作用，而不同內含子的pre-tRNA可以被容納和裂解，解析了人類TSEN去除pre-tRNA內含子的分子機制。

值得一提的是，施一公及張曉峰團隊于兩個月前發表的研究論文：Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly，揭秘三種RNA解旋酶作用機制——人U2 snRNP組裝中RNA解旋酶DDX42和DDX46的作用機制，為癌癥突變機制提供新見解。

施一公院士團隊是世界上首個、也是唯一一個成功捕獲并解析了RNA剪接過程中所有完全組裝剪接體高分辨率三維結構系列成果的團隊。從組裝到被激活，從兩步轉酯反應發生到剪接體的解聚，各種各樣狀態的剪接體完整覆蓋了剪接通路，首次將剪接體介導的RNA剪接過程完整地串聯起來，為理解RNA剪接的分子機理提供了最清晰、最全面的結構信息，成功獲取剪接體這顆分子生物學皇冠上的明珠。

圖 5：剪接體結構匯總（來源：https://ygshi.org/research）

目前，施一公團隊克服技術障礙，深入探索生命細節，獲得人類TSEN/CLP1/pretRNA復合物在催化前和催化后狀態下的結構，為理解pre-tRNA剪接的機制提供了一個全新的框架。如此振奮人心的研究結果令人看到了科學家們孜孜不倦的努力，從基礎科學的研究到臨床應用，再到治療疾病，未來可期。