Molecular Devices使用多能誘導干細胞(iPSC)來源的肝細胞球進行高內涵3D毒性分析
特點：
使用人類多能誘導干細胞來源的肝細胞形成肝細胞球
對體外篩選的3D模型進行肝毒性評價
3D圖像分析過程中對目標樣品進行識別和分割，以達到最佳分割效果
背景介紹：
在發育生物學和組織生物學中，3D細胞球建模方式能夠加快轉化研究進程，因此越來越受到人們的重視。如何對3D樣本進行更高通量的定量分析成為了熱門研究課題。
在本實例中，MD公司建立并優化了一種分析方法，能夠對人類多能誘導干細胞來源的3D肝細胞球進行共聚焦成像和毒性評估（圖1）。
使用免洗染色法進行肝毒性評價：
用肝毒性測試化合物處理細胞球72小時
用溶解于無菌PBS中的三種熒光染料對細胞球進行染色。三種染料的濃度分別為：
2 μM calcein AM
3 μM EthD-1
10μM Hoechst 33342 (Life Technologies)
此外，為了評價化合物對凋亡信號的激活和對線粒體形態的影響，所用的染料濃度分別為：
7.5 μM CellEvent Caspase 3/7
200 nM MitoTracker Orange (Life Technologies)
肝細胞球的形成：
本實例使用的細胞為：
人類多能誘導干細胞來源的肝細胞 iCell Hepatocytes 2.0 (Cellular Dynamics International)
HepG2細胞 (ATCC)
操作流程
按照標準操作流程將凍存細胞復蘇；
iCell Hepatocytes 2.0 鋪板進行2D培養；
貼壁細胞用Accutase酶消化后與Geltrex 基質(ThermoFisher Scientific)混合，細胞混合液以1000 cells/well的密度種植在低吸附成球孔板中(InSphero or Corning)；
將孔板以300 g轉速離心2分鐘使細胞沉淀并去掉基質中的氣泡，然后將孔板放入細胞培養箱，在37°C, 5% CO2條件下進行培養。培養HepG2 細胞無需加入基質；
培養24–48小時后細胞球形成。
將染料加入細胞球培養體系中孵育2小時，然后采集圖像。染料無需洗脫，加樣過程小心謹慎，避免損傷細胞球進而造成細胞球解體或偏離原位。典型的細胞球染色結果如圖 2所示。
高通量3D圖像的采集和分析過程：
采用ImageXpress? Micro 共聚焦高內涵成像系統(Molecular Devices)采集圖片，具體設置如下：
物鏡種類--10倍鏡和20倍鏡
層掃間距--5-10μm
層掃范圍--100-120μm
層掃起始位置--多孔板孔底
所有的結果中都包含有2D maximum投射圖像，分析過程中可以對這些圖像進行保存和調用。
識別并分析3D樣品
使用MetaXpress? 高內涵圖像采集分析軟件對3D圖像進行分析。CME用戶模塊編輯器中新增了3D分析模塊(圖3) ，該模塊能夠對3D結構的體積、熒光強度、距離等參數進行量化并對圖像進行批量分析。其中 “Find Spherical Objects”功能可以對目標結構的形態學參數（最小和最大寬度，最小和最大Z軸層數）和目標結構與背景之間熒光強度的差值進行自定義設置，對不同大小的目標結構（小到細胞器，大到多細胞團）進行定義。比如將形態參數設定為：
細胞核寬度范圍--5-15 μm
細胞核層數--1-2層
細胞核與背景的熒光強度差--200 熒光單位
肝細胞球寬度范圍--100-300 μm
肝細胞球層數--5-7層
肝細胞球與背景的熒光強度差-- 400 熒光單位
分析結果包括每個目標結構的球體體積、直徑（或平均體積、平均直徑），以及特定熒光通道中球體的總熒光強度和平均熒光強度等參數。
