“Find Spherical Objects”功能還可用于識別單個細胞和細胞核或利用適當的特征將不同的單細胞區別開來。此外，3D分析模塊可以按照用戶自定義選項“Connect by BestMatch”, “Connect byTouching”, 和 “Do NotConnect Objects”將不同層面的目標結構連接起來。
首先對Z軸層掃中的每層圖片按照2D圖片進行分割、分析并得到細胞核個數，細胞死/活和細胞分類等參數的測量值；其次利用用戶定義的目標結構的最大范圍將其連接起來。如：
細胞核最大范圍 3-6 μm
細胞質最大范圍 20-30 μm
最終，在3D結構中將細胞核或單細胞分割出來。整個過程中目標結構不會丟失也不會被重復計數。所有的細胞（如：calceinAM 陽性/陰性細胞；Ethidium homodimer陽性/陰性細胞）都會被識別、被計數。
為了直觀表現目標結構的整體/平均熒光強度、體積、直徑、間距以及目標結構在三維空間中的定位等參數，可用不同顏色標記單個細胞。利用細胞球標記范圍（ spheroid masking ）對更小的結構進行計數，這些結構可能在標記范圍（mask）之中或在標記范圍（mask）之外。如：對每孔只含有一個細胞球的樣品進行分析時，利用單細胞標記（ single-cell masking ）可以對所有細胞進行計數并將位于細胞球中和細胞球外的細胞區別開來。當細胞球不完整時，這種圖形處理方式就顯得十分重要。對每孔含有多個細胞球的樣品（細胞球與基質共培養）進行分析時，這種圖形處理方式可以定義每個細胞球的容量并得出均值。
圖 4A 顯示了不同層面的2D圖像中 calceinAM 陽性細胞的細胞分類結果。利用“Connect by Best Match” 功能可以將細胞在3D空間中連接起來。相同的方法可以分析 ethidium homodimer 陽性/陰性細胞(細胞死/活分析) 也可以分析線粒體、熒光強度、細胞凋亡還可以分析特定染料和標記物。
使用多參數表型篩選結果進行毒性評價
利用多種肝毒素處理細胞球，觀察細胞球表型和細胞含量的顯著變化。許多細胞球失去了球狀結構，球體發生崩解，細胞球變得松散、扁平、不規則。細胞從主體結構中脫離，或出現凝結核，表明細胞已經死亡。 當化合物濃度超過一定范圍，細胞表型就會出現上述變化 (圖4B)。 利用圖像量化分析得到的參數對細胞球的形態特征、細胞含量和結構復雜程度進行評估。檢測細胞球體積、直徑、熒光強度，同時檢測calcein AM 陽性細胞(活細胞)、EthD-1 陽性細胞（死細胞）個數。細胞球經化合物處理后，細胞總數沒有變化，死細胞數量上升，活細胞數量下降（具有濃度依賴特性）；細胞球和單個細胞（細胞質）中calcein AM的平均熒光強度顯著降低。
為進一步研究細胞毒性機制，我們對細胞的凋亡特征和線粒體完整性進行評估。化合物處理細胞球24小時后用caspase 3/7 熒光染料檢測細胞凋亡的活化程度。 caspase 3/7 對細胞球（經甲基汞處理的對照組細胞球）的染色結果如圖2B所示。用化合物處理細胞球后會誘導細胞凋亡，導致 caspase 3/7 熒光強度增加，caspase 3/7 陽性細胞（凋亡細胞）的個數增加。 用MitoTracker Orange 熒光染料染色結果來反映線粒體膜電位的變化情況。用化合物處理細胞球后會破壞線粒體結構的完整，進而導致MitoTracker Orange熒光強度降低（具有濃度依賴特性，圖2C ）
對活細胞個數、 calcein AM 熒光強度、 calceinAM 陽性細胞含量等參數進行測量后發現這些參數都完美的符合四參數劑量反應曲線模型(圖 4B)。IC50 值 (表 2) 由SoftMax? Pro 6 軟件(MolecularDevices)生成。
總結：
在對肝毒性進行評價的過程中，3D肝臟球模型+高內涵3D分析模式作為一種反應靈敏、可重復性高的方法，越來越展現出廣闊的應用前景。該方法預測準確率相比于動物實驗和臨床數據仍需要繼續完善。相關模型的進一步發展，檢測方法的進一步優化有利于拓展該方法在體外篩選領域中的應用空間。
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