NGS文庫制備的方法比較

　　近年來，新一代測序(NGS)技術的應用日益廣泛。隨著測序技術的不斷改進，制備核酸和構建NGS文庫的方法也在改進。對于各種文庫制備方法，我們該如何選擇?近日，美國斯克里普斯研究所的研究人員在《Biotechniques》上發表文章，比較了各種文庫制備策略。

　　總的來說，在NGS分析之前，制備RNA或DNA的主要步驟包括：片段化和/或篩分指定長度的目標序列;將目標片段轉化成雙鏈DNA;在片段末端連上寡核苷酸接頭;以及定量最終的文庫。

　　DNA片段的大小是NGS文庫構建的主要因素。DNA片段化主要是通過物理方法(如超聲破碎)或酶學方法(即非特異的核酸內切酶處理)來實現的。作者將這兩種方法進行了比較，發現它們都很有效。不過，與物理方法相比，酶學方法(Fragmentase)產生更多人為的插入缺失。作者還提到了Illumina的Nextera技術，認為它能夠減少樣品處理并節約時間。

　　作者提到，在制備DNA樣品的文庫時，應考慮幾點，包括起始材料的量以及測序應用。若基因組的GC含量較高或較低，文庫制備有可能會出現偏向。此時應精心選擇PCR擴增的酶、條件以及緩沖液，來解決這些問題。

　　目前有多家公司提供制備DNA測序文庫的試劑盒。競爭使得價格穩步下降，質量不斷上升。這些試劑盒可從微克至皮克級的起始材料開始制備文庫。不過，大家應該記住這一點，起始材料越多，意味著擴增越少，文庫復雜性越好。

　　對于RNA測序實驗，作者認為，在決定文庫制備的方法之前應考慮實驗的主要目的。如果目的是發現復雜和整體的轉錄事件，那么文庫應捕獲整個轉錄組，包括編碼、非編碼和基因間RNA，盡可能完整。然而，在很多情況下，人們的目的只是研究翻譯成蛋白的編碼轉錄本。此外，有些研究的目的是分析小RNA，主要是miRNA，或snoRNA、piRNA等。作者列出了各個實驗的選擇指南。

　　作者還提到，制備測序文庫時的主要目標是產生盡可能少的偏向(bias)。偏向可被定義為因實驗設計而產生的數據系統失真。既然不可能消除所有來院的實驗偏向，那么我們至少要了解，偏向發生在哪里，并采取一切可行的步驟來盡量減少;注意實驗設計，讓不可能消除的偏向對最終分析的影響最小。

　　此外，作者還詳細介紹了各個NGS應用的樣品制備方法，包括靶向測序、mate pair測序、ChIP-Seq、RIP-Seq以及Methylseq，并討論了從單細胞制備文庫的方法。