測序技術是單基因遺傳病診斷應用的主要技術，針對檢測基因的范圍可大體分為單基因檢測技術和多基因檢測技術。單基因檢測是指針對某一特定基因進行測序的技術，適用于具有特異疾病表型的疾病。單基因檢測技術中應用最廣泛的是Sanger測序，也稱一代測序。Sanger測序因僅能檢測一個或少數幾個基因，因此適用于明確可識別的特異性表型的疾病診斷。多基因檢測技術主要是NGS測序，也稱二代測序。可以對基因組的成百上千個基因、甚至全部人類基因進行大規模的平行測序，同時對產生的數十萬至數百萬的數據進行同時讀取。常有人把一代測序和二代測序比喻成“釣魚”和“捕魚”。
Sanger測序的優勢是成本低、覆蓋度高，對于目標非常小的測序任務，如驗證某一個位點的變異，或者檢測幾個外顯子，則非常適用。其次準確性相對高，準確率可以達到99.999%。第三檢測周期相對短，只需要2至4周就能得到檢測結果。Sanger測序最大的應用局限性就是通量低，只能對一個或少數幾個基因變異導至的高度特異的臨床表型進行確診。其次是靈敏度低，Sanger測序是以峰圖形式呈現，用于檢測純合或雜合變異，但是對于檢測樣本中體細胞嵌合體、線粒體DNA等低豐度變異則無法檢測到。另外Sanger測序只能對特定基因進行檢測，有可能檢測到意義未名的變異（Variants of Unknown Significance，VUS），但無法實現新致病基因的科研發現。
今天隆重介紹的就是當下測序的主要檢測技術——高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS），該技術可以實現多基因大規模平行測序，可以從根本上解決單基因遺傳病因異質性、基因多、表型復雜造成診斷難的實際問題。NGS實驗流程是一個文庫制備→芯片捕獲→測序→數據分析的過程，基于NGS測序技術有三類檢測方案：
一、NGS-目標疾病類捕獲方案（Panel方案）
Panel檢測是針對某一特定類別疾病的相關基因，如下圖-中圖：
Panel檢測適用于以下幾種情況：
（1）基因研究清楚的特定表型的診斷。如遺傳性痙攣性截癱、腦白質營養不良、CMT等。
（2）重疊疾病表型的診斷。如肌病Panel，雖有重疊表型，但又屬于不同疾病類，可用不同Panel檢測。再如癲癇，遺傳代謝病引起的代謝性癲癇和幼嬰癲癇性腦病均以癲癇為主要表現，分屬不同類別，且有各自表型特點，也應采用不同Panel檢測。
（3）屬于同一類致病機制或分子途徑的疾病。如離子通道病神經系統疾病進行Panel檢測。
Panel檢測技術優勢：檢測基因數目少，使檢測成本相對低，數據分析速度快，整體檢測周期短。另一顯著的優勢，在蛋白編碼區域能達到很深的測序深度與覆蓋度，這對臨床診斷來說至關重要，因為高深度意味著準確率高。Panel檢測因為是對已知基因進行目標基因檢測，最大的局限性就是只能檢測Panel內的基因。如果疾病致病基因不在Panel里則不會被檢測到，隨著疾病的新的致病基因被發現，或對非典型表現的認識程度加深，有些Panel可能會因為基因不全而應用受限，這就需要再重新設計Panel。
二、NGS-全部外顯子組捕獲方案（WES方案）
全外顯子組檢測（Whole Exome Sequencing，WES）（上圖-左），WES檢測不局限于特定選擇的基因，范圍是人類已知20000多基因的編碼區序列，大概是整個基因組的1-2%，但卻包含了基因變異的85%。因此，WES檢測是在已知基因下針對SNVs這種變異最全面的方案。據研究統計，孟德爾遺傳病通過WES檢測的陽性率可以達到22%至31%。神經系統疾病用WES檢測診斷陽性率（30.6%）比非神經系統遺傳病陽性率（如：皮膚系統17.2%、血液系統疾病17.1%）更高。用WES方案檢測癲癇或共濟失調可以達到總體36.1%的陽性率。
WES檢測適用于：
（1）表現為遺傳異質性疾病的診斷。如自閉癥或發育障礙、線粒體疾病，這類疾病常涉及多種表型系列，且致病機制復雜。
（2）一個患者表現出兩種或以上的完全獨立系統疾病的復雜情況。如：患者既有眼皮膚白化病又有中性粒細胞減少又有癲癇表現，這樣患者選擇方案時選兩個或兩個以上的Panel反而會增加成本。
（3）患者全身多系統受累。如：一些綜合征類疾病，像Kabuki綜合征，表現為特殊面容、骨骼發育障礙、多發畸形等。或Zellweger綜合征，表現全身多發畸形、神經系統癥狀、肝功能和腎功能異常等多種表現。
WES檢測優勢是全面，是對全部基因的外顯子進行檢測。相比于Panel，會有更大的發現新致病基因的可能性。可以檢測到編碼區的VUS變異，用于人類基因組外顯子研究非常重要。WES最大的挑戰就是數據分析，WES通常有150-200×的測序深度，平均測序深度不低于100×，并且20×深度的基因覆蓋度也是數據質量可靠的重要參考指標。
三、NGS-全基因組測序方案（WGS方案）
全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）檢測范圍最全面，不用捕獲，是對整個基因組進行檢測，不僅能檢測編碼區，還可以檢測到非編碼區以及調控區，以及一些結構變異。但WGS的局限性也是顯而易見的。首先，因WGS是對整個基因組檢測，會檢測到很多內含子和基因間區域內變異，而這些變異的功能在很大程度上是未知的，因此這些被檢測的未知數據的分析解讀是一個難題。其次，如果保證數據深度（100×）和質量的條件下，WGS會比WES高于3-5倍甚至更高的檢測成本。第三，由于數據量的增多，在數據存儲、數據分析、數據過濾注釋等方面需要建立的方法都要比WES更加復雜。最后，WGS無大樣本罕見變異參考，即使檢測到的數據，也可能無致病性分析的參考。
檢測方案的選擇要從患者實際患病情況出發，為患者選擇最適合方案以達到精準診斷的目的。有兩點選擇標準：
一、表型越非特異越應選擇相對全面的方案
表型異質性與特異性示意圖（Wright CF et.al. Nat Rev Genet. 2018.）
當一個疾病表型很確定時，只需要選擇相對明確的直接檢測，如圖，假如能確定囊性纖維化，只檢測CFTR基因即可，應用NGS測序都已屬于過度檢測。而對于一些非特異性的我們也稱為遺傳異質性表型，為達到更高陽性檢出率必須做相對大而全的方案。
二、Trio模式比先證者模式檢測更嚴謹
先證者模式是只對家系中第一個發現該病的患者（先證者）一個人進行檢測，數據分析后有疑似致病性位點，再進行父母或其他患病成員的家系Sanger測序驗證。家系模式是對先證者及其父母三個人全部進行NGS測序。Trio模式會提高陽性診斷率，如嚴重發育障礙患者，先證者模式WES陽性診斷率是28%，Trio-WES的陽性診斷率可以提高至40%，增加了12%的陽性診斷率。這是因為家系模式可以從遺傳學上考慮見到更有意義的變異位點，如：De novo突變、純合突變、復合雜合突變、X連鎖疾病半合子突變、單親二倍體、家系表型-基因型共分離，通過家系篩查可以判斷變異致病性，有更強的遺傳學證據，同時避免出現先證者模式可能造成的假陽性結果。
隨著近年來高通量測序技術的發展，以及測序成本的降低，高通量測序技術已逐步替代經驗診斷為主導的單基因測序技術，成為遺傳病診斷的主要遺傳學檢測技術。基于高通量測序技術平臺，衍生出不同的檢測方案。不同檢測方案均有其檢測適應癥、優勢及局限性，在方案選擇上要充分考慮患者臨床表型，以及疾病與基因相關性進行綜合評估，選擇能夠為患者帶來最好診斷效果的檢測方案。當下測序技術本身已不是瓶頸，核心關鍵在于高通量測序后得到的海量數據的數據分析與數據挖掘。運用高通量測序技術，結合生物信息學分析、遺傳學分析、臨床表型分析等進行多學科綜合分析與解讀，最終實現對單基因遺傳病患者進行精準病因學診斷。