NK細胞活性測定實驗——放射性核素釋放

靶細胞

SDS生理鹽水臺盼藍染色液鉻酸鈉

細胞培養板離心管平皿

一、材料準備

1.  靶細胞制備

（1）取傳代培養24~48小時對數生長期的K562，用RPMI-1640培養液洗滌2次，用10%FCS-RPMI-1640培養液調細胞濃度4×10⁶/ml。

（2）0.5 ml K562細胞懸液加3.7~7.4MBq（100~200uCi）⁵¹Cr，5%CO₂，37度孵育90分鐘，每個15分鐘振搖一次。

（3）RPMI-1640培養液洗滌3次，洗去未標記的游離⁵¹Cr。

（4）10%FCS-RPMI-1640培養液調細胞濃度1×10⁵/ml，同時檢測細胞的⁵¹Cr標記率，一般要求標記率＞0.1 cpm/cell。

（5）如暫時不用，可放置4度保存12小時。

2.  效應細胞制備：淋巴細胞分層液分離人PBMC，10%FCS-RPMI-1640培養液調細胞濃度1×10⁷/ml

二、操作步驟
 

1.  加樣：取上述效應細胞和靶細胞各0.1 ml（E：T=100：1）加入96孔培養板內，3復孔。同時設自然釋放對照孔（0.1 ml 靶細胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培養液）和最大釋放孔（0.1ml靶細胞+0.1 ml 2%SDS）。37度，5%CO₂孵育4小時。

2.  測定：1000 r/min 離心培養板5分鐘，用微量移液器吸出各孔上清0.1 ml，加于計數管內，用γ計數儀測定放射活性cpm值。

3.  計算：根據下式計算51Cr自然釋放率和NK細胞毒活性

^（1）51Cr自然釋放率（%）=（自然釋放孔cpm值）/（最大釋放孔cpm值）×100%

（2）NK細胞毒活性（%）=（試驗孔cpm值-自然釋放對照孔cpm值）/（最大釋放對照孔cpm值-自然釋放對照孔cpm值）×100%

1.  靶細胞的質量非常重要，用臺盼藍拒染色法檢測K562靶細胞的存活率應＞95%。標記后的自然釋放率應＜15%。

2.  效靶細胞比率一般選擇50~100：1，其自然殺傷率不再呈對數增加，標本用量過大。

3.  由于放射性核素具有毒性，標記的靶細胞不宜放置過久，與效應細胞作用時間也不宜過長，因隨時間的延長死細胞增多，自然釋放率也隨之增高。