NatNeurosci∣環狀RNA或可成為阿爾茲海默癥的臨床新指標

　　阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是世界衛生組織公認的全球公共衛生重點。AD是一種由多種原因引起的、不可逆轉的神經退行性疾病，是癡呆中最常見的一種類型，主要表現為進行性記憶喪失、認知功能障礙、注意力散漫、情感障礙、人格變化等特點，在疾病的最后階段，患者表現為臥床不起，需要24小時護理，最終致命【1】。研究發現，AD的病理學特征主要為β淀粉樣蛋白（beta-amyloid protein, Aβ）在大腦皮層和海馬區沉積形成老年斑、神經元細胞內神經纖維纏結及腦皮層和海馬區神經細胞減少，膽堿乙酰轉移酶（ChAT）和乙酰膽堿（Ach）含量顯著減少【2】。AD的發病與年齡、遺傳因素及環境因素密切相關，然而，到目前為止，仍不能在早期階段確診AD，且該病的病因和發病機制仍未完全研究清楚。

　　近年來，分子生物學技術的發展使得研究人員在探索編碼和非編碼轉錄組的復雜網絡中越來越游刃有余，在這個過程中，人們發現了一類新型的內源性非編碼RNA——環狀RNA（Circular RNA，circRNA）。與線性RNA（如mRNA、microRNA和lncRNA等）具有5’帽子和3’尾巴的結構不同，circRNA是通過反向剪接形成的共價閉環結構。早在20世紀70年代，科學家就利用電子顯微鏡在RNA病毒中發現了環狀RNA分子，然而，在那時，circRNA被認為是拼接的人工產物，并且在大約20年的時間里一直被認為是“垃圾”RNA，直到轉錄組測序和生物信息學分析出現新的進展，人們發現circRNA在哺乳動物細胞中的高豐度、高穩定性和高保守性，才使得其重新獲得研究者的重視。越來越多的研究證實，circRNA可以通過吸附microRNA、與RNA結合蛋白相互作用或調節轉錄來調控基因的表達，甚至可以翻譯產生多肽【3】。更重要的是，circRNA表達的組織特異性調控已被發現與許多疾病的發生和發展密切相關，包括各種癌癥、心血管疾病和神經系統疾病【4】。

　　研究發現circRNA在神經系統中高度表達，且在突觸中富集。在大腦中，circRNA的表達可以獨立于其線性轉錄表達，并且可能是一個基因中表達量最高的亞型。腦內circRNA在發育和對神經元興奮的反應中也受到一定程度的調控。已有研究發現一個可以調節特定microRNA和突觸功能的circRNA——CDR1-AS在AD大腦中表達下調。基于以上，我們不禁好奇，在AD的發生發展過程中，circRNA扮演著什么樣的角色呢？circRNA的存在是否對于AD的診斷、治療有著至關重要的作用呢？

　　2019年10月7日，來自美國華盛頓大學醫學院的Carlos Cruchaga教授研究團隊在Nature Neuroscience上在線發表題為An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations的文章，對AD患者中circRNA的差異表達及其與AD臨床和神經病理學嚴重程度的關系進行了全circRNA轉錄組分析，為我們解答了上述問題，提出circRNA與AD發生發展進展關系密切，并有望成為臨床早期診斷的新靶標。

　　本文的分析研究是建立在調用和量化來自兩個獨立的RNA-seq數據庫中的circRNA數據，這兩個數據庫的數據均來源于神經病理學證實了的AD病例和對照腦組織。第一個數據庫——discovery數據庫，其RNA-seq數據來源于96個個體（13例對照和83例AD患者）捐獻的冷凍頂葉皮層組織，另一個用于重復實驗的數據庫——西奈山腦庫（Mount Sinai Brain Bank，MSBB）的RNA-seq數據來源于195個樣本（40例對照、89例確診AD患者、31例大概率AD患者及35例疑似AD患者）的額下回組織和另外三個皮層區域。首先，研究人員利用STAR軟件進行嵌合讀取檢測模式，將兩個RNA-seq數據庫的數據與GENCODE注釋的人類參考基因組（GRCh38）進行匹配，利用DCC軟件進一步處理和過濾嵌合讀數，以識別反向剪接連接處，然后將此數據折疊至它們的起源線性基因上，生成一組高度可靠的circRNA數據以用于下游分析。根據這個方法，本研究在discovery數據庫中調用了3547個circRNA，而在MSBB中的四個腦區域數據中平均調用了3924個circRNA。

　　隨后，本文研究人員使用DESeq2軟件對神經病理學AD病例及對照進行circRNA差異表達分析，并與臨床AD定量指征—Braak評分（從神經病理學角度評估AD嚴重程度，由腦內神經原纖維纏結的數量和分布決定）和臨床癡呆評分（CDR，認知障礙的臨床測量指標）進行相關性分析。結果顯示，在discovery數據庫中共鑒定出37個與至少一個AD性狀顯著相關的circRNA，而在MSBB數據庫中分析發現164個與至少一個AD性狀顯著相關的circRNA，從而表明circRNA的表達與AD的診斷、臨床癡呆的嚴重程度和神經病理學的嚴重程度之間存在顯著的相關性（圖1）。與此同時，本文分析研究還證明，大多數circRNA-AD相關性與同源線性mRNA的表達或預估的腦細胞類型比例的變化無關，并且某些circRNA的表達變化在AD的不同皮質區域是一致的。

圖1 皮質circRNA與AD特征相關性

　　進一步地，為了探討circRNA的表達是否在AD實質性癥狀出現前發生變化，以及這些變化是否局限于隨機發生的AD，本文的研究者又將circRNA分析擴展到癥狀出現前的AD樣本（即已有神經病理學證實，但還未出現明顯癥狀，CDR≤0.5）和常染色體顯性遺傳AD樣本（ADAD），結果顯示，在AD癥狀出現之前，circRNA在多個皮層區域表達出現早期變化，并且circRNA表達的變化在ADAD的情況下也會發生，而且即使根據神經病理學的嚴重程度進行調整，其變化幅度也只會更大。

　　最后，本文研究人員通過相對重要性分析、共表達網絡分析和miRNA結合位點預測分析，探討AD相關circRNA的AD相關性和潛在的疾病影響機制。結果顯示，與已知的兩個因素——APOE4等位基因的數量（AD最常用的遺傳風險因子）和神經元估計比例——相比，circRNA的變化能更好的反映AD特征；此外，AD相關的circRNA與已知的AD基因存在共表達關系，并且這些circRNA存在潛在的microRNA結合位點，可以用于預測以AD基因為靶點的microRNA。

　　綜上所述，本研究證實，即使沒有人口統計學或APOE4危險因素數據，circRNA的表達也能對AD的病情產生很強的預測能力；同時，結合circRNA在腦脊液和血漿等生物體液中的相對穩定性以及它們在外泌體中的富集的特點， circRNA也可能會被用作癥狀前和癥狀性AD以及其他潛在的神經退行性疾病的外周生物標志物；由此，進一步強調了分析非線性RNA的重要性，并為未來探索circRNA在AD發病機制中的潛在作用的研究提供了方向。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41593-019-0501-5

　　參考文獻

　　1. Alzheimer's Association. 2016 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 2016 Apr；12(4):459-509.

　　2. Lane CA, Hardy J, Schott JM. Alzheimer's disease. Eur J Neurol. 2018 Jan；25(1):59-70.

　　3. Li X, Yang L, Chen LL. The Biogenesis, Functions, and Challenges of Circular RNAs. Mol Cell.2018 Aug 2；71(3):428-442.

　　4. Zhang Z, Yang T, Xiao J. Circular RNAs: Promising Biomarkers for Human Diseases. EBioMedicine. 2018 Aug；34:267-274.