同源末端重組 (HR) 和非同源末端重組 (NHEJ) 是細胞遭受DNA雙鏈斷裂 (DSBs) 之后進行損傷修復的兩個重要武器，并分別由各自通路中的關鍵蛋白BRCA1 (HR) 和53BP1 (NHEJ) 所介導。它們的相同之處在于，BRCA1和53BP1都需要同時結合在H2AK15ub (由泛素E3連接酶RNF168催化) 和H4K20這兩個位點而被招募到損傷位點；不同的是，53BP結合H4K20位點需要攜帶甲基化修飾(H4K20me1和H4K20me2)，而BRCA1則識別非甲基化的H4K20 (H4K20me0)，這種表觀狀態只會在DNA復制期間 (G1期) 出現在新合成的組蛋白上。因此，HR和NHEJ通常各司其職，并在不同的細胞周期中各自發揮功能【1,2】。
現在已知的是，53BP1會分別通過其TTD (tandem-Tudor domain) 和UDR (ubiquitin-dependent recruitment)結構域來識別H2AK15ub和H4K20me1/2位點【3】，而BRCA1則會通過其伴侶蛋白BARD1與非甲基化的H4K20結合【4】，至于BRCA1是如何識別H2AK15ub位點？這個問題一直困擾著學界。
2021年7月28日，來自牛津大學韋瑟爾分子醫學研究所的J. Ross Chapman研究團隊在Nature上發表了題為 BARD1 reads H2A lysine 15 ubiquitination to direct homologous recombination的研究文章，揭示了BRCA1被招募到DNA 雙鏈斷裂位點的具體分子機制，破解了該領域長期懸而未決的難題。
圖片
首先，作者推測BRCA1 -BARD1復合體可能是通過BARD1與H2AK15ub結合，于是作者通過單個氨基酸位點突變和表型篩選，鑒定到BRCT結構域上R705, D712, Q715可能是結合的關鍵位點 (BARD1蛋白包含一個N端RING結構域、中間的ARD結構和C端兩個串聯的BRCT結構域, 如圖1)，并且這三個氨基酸之間會形成一段結構保守的loop。進一步，他們發現ARD結構域與這三個位點的功能相互關聯。這些結果提示，BRCT與ARD結構域可能共同參與了BRCA1-BARD1復合體與組蛋白的結合。
圖1 通過結構分析、點突變和表型篩選尋找BARD1結合組蛋白的關鍵位點
為了找到BRCT結合H2AK15ub位點的直接證據，作者進行了體外pull-down實驗。借助體外pull-down，他們證明BRCT的確可以在ARD協同下特異性地與H2AK15ub位點結合，并且BRCT只會結合H4K20非甲基化修飾的染色質。為了與53BP1蛋白的UDR結構域保持一致，他們將BRCT三個關鍵氨基酸所形成的loop命運為BUDR結構域。至此，作者已經找到了BRCA1 -BARD1復合體識別H2AK15ub位點的關鍵結構域。
最后，作者展開了細胞功能驗證，并且作者證明BRAD1識別雙鏈斷裂位點是由RNF158催化的H2AK15ub所介導。考慮到H2AK15ub同樣會招募53BP1到達損傷位點，為了使兩者的功能不會“起沖突”，作者推測BRAD1可能會通過某種機制去抑制53BP1通路的激活。作者發現在BRAD1Δ/Δ細胞中，BRCA1下游的效應蛋白RAD51不能識別損傷信號，而在53BP1-/ -BRAD1Δ/Δ細胞中則又可以被招募至損傷位點，這說明抑制53BP1介導的NHEJ會增強HR的功能。但是HR的修復能力卻并沒有被完全恢復，有趣的是，在53BP1-/ -BRAD1Δ/Δ細胞中回補野生型以及與染色質結合功能缺失的BRAD1都可以恢復HR的全部功能，這說明BRCA1 -BARD1復合體會存在一種不依賴BARD1與染色質結合的方式被招募到損傷位點。
總結一下：這項研究實際上回答了圍繞DNA雙鏈斷裂修復通路的兩個長期未被回答的科學問題：第一，DNA損傷產生的H2AK15ub信號是如何招募BRCA1-BRAD1到達損傷位點；第二，該復合體在介導同源末端重組修復的同時如何抑制53BP1介導的非同源末端重組 (模式圖)。這一發現讓我們對于DNA損傷修復通路有了新的認識。
模式圖
參考文獻
1. Doil, C. et al. RNF168 binds and amplifies ubiquitin conjugates on damaged chromosomes to allow accumulation of repair proteins. Cell 136, 435–446 (2009).
2. Stewart, G. S. et al. The RIDDLE syndrome protein mediates a ubiquitin-dependent signaling cascade at sites of DNA damage. Cell 136, 420–434 (2009).
3. Botuyan, M. V. et al. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell 127, 1361–1373 (2006).
4. Nakamura, K. et al. H4K20me0 recognition by BRCA1–BARD1 directs homologous recombination to sister chromatids. Nat. Cell Biol. 21, 311–318 (2019)