Nature：5種RNA測序法終極PK

　　近日，美國哈佛大學與麻省理工學院的研究人員，將5種不同的轉錄組測序( RNA -seq )法進行了對比，比較結果顯示 RNAse H 技術在分析低質 RNA 樣品方面優于其他技術，且價格最為便宜; SMART 和 NuGEN 法適應于分析少量 RNA 。兩篇研究論文在線發表在5月19日的《自然方法》(Nature Methods)和《自然》(Nature)雜志上。

　　由于RNA 在一段時間內會發生降解，研究人員一直在尋找一種方法來解決這一問題。研究人員嘗試了不同的方法，最終發現 RNAse H 法很好用，能夠給出一致的結果。

　　RNA-seq 是一種利用高通量序列測定，來測序和定量 RNA 進行轉錄組分析的方法。然而當研究人員利用少量降解或少量殘存的樣本進行 RNA -seq 時，他們得到的是受損的結果。Adiconis說，當前有許多的方法和商業試劑盒可用于分析低質和低量的樣本，但直到現在人們也只能在某種程度上依靠猜測對這些方法進行選擇。

　　在第一項發表在《Nature Methods》的研究中，研究小組通過測試這些技術清除低質樣本中核糖體 RNA(rRNA )的能力，發現 RNAse H 能夠清除低質樣本中幾乎所有的rRNA ，只有 1% 的量殘存。而 Ribo-Zero 法留下了 11.3% ,的 rRNA ， NuGEN 法留下了23.2%。此外，對于低質 RNA ， RNAse H 和Ribo-Zero法在大多數量度，例如文庫復雜性(樣本中文庫復雜性越高，就越能更好地代表 RNA )和覆蓋均勻度等方面看起來更優。

　　研究小組隨后采用真實樣本：一個福爾馬林固定、石蠟包埋的腎樣本，以及一個分離過程中發生了降解的胰腺樣本，比較了 RNAse H 和Ribo-Zero。最終，科學家們發現 RNAse H優于Ribo-Zero，提供了略微更均勻的覆蓋。

　　鑒于它們在特異針對性清除 rRNA 序列方式上的根本差異，總體而言， RNAseH 和 Ribo-Zero 優于其他的方法。例如， RNAse H法是采用預先設計的DNA寡核苷酸結合核糖體 RNA 序列，隨后 RNAse H 酶消化DNA- RNA 雜交物。研究人員表示，這種靶向性的方法相對不影響剩余的轉錄組。

　　相比之下，其他的方法，如 polyA 篩選法、DSM 和 SMART ，是通過篩選多聚腺苷酸mRNA (poly-adenylated mRNA )或是清除高度豐富的 RNA 種類的方法，來間接清除核糖體 RNA 。這些技術在清除核糖體 RNA 的同時，也引入了降解樣品覆蓋偏倚。

　　此外，Ribo-Zero、 NuGEN 和 SMART 商業試劑盒一個樣本的成本，要大大高于 DSN-lite 和 RNAse H 等其他方法。組裝這些文庫所需的勞動量大致相同，除了 DSN-lite 需要多一天之外。

　　盡管 RNAse H 看起來是一個明顯的贏家，一種方法的選擇要主要是取決于研究目的。例如， NuGEN 能夠極好地應用于非常量小的樣本。研究人員表在，這項研究中測試是1 ng和100 ng的樣本量，但實際 NuGEN 方法可以達到比這更低。它也非常適用于已經降解的 RNA 。

　　SMART 方法也適用于微小樣本，不過其要求 RNA 必須是完整的。

　　而在另一項發表在《Nature》雜志上的研究中，研究人員利用 SMART 方法對單個免疫細胞的轉錄組進行了測序，揭示了這些單細胞在基因表達上的異質性。

　　研究小組過去一直采用 NuGEN 來測量單個病毒顆粒的轉錄組，單個病毒顆粒的 RNA 量不超過 1 皮克。研究人員表示，由于從未嘗試過用 NuGEN 法來檢測單細胞，因此無法判定哪個更好一些。