一．原理
Northern 雜交是用來測量真核生物RNA的量和大小估計其豐度的實驗方法，可以從大量的RNA樣本同時獲得這些信息。其基本步驟包括：
1. 完整mRNA的分離
2. 根據RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離
3. 將RNA 轉移到固相支持物上，在轉移的過程中，要保持RNA 在凝膠中的相對分布
4. 將RNA固定到支持物上
5. 固相RNA與探針分子雜交
6. 除去非特異結合到固相支持物上的探針分子
7. 對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析
二．DNA 探針的制備與標記
1．材料
純化的PCR產物
2．儀器
電泳儀，紫外分析儀， 離心管，移液槍，碎冰
易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
3．試劑
10× transcription buffer；10× nucleotide mix (10mm each ATP GTP CTP)；20U RNase
inhibitor；40U T7，T3or SP6 RNA Polymerase；DMPC處理水；DNase I (40U) RNase free；
EDTA (0.2M PH 8.0)；RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)
4． 方法
(1) 將10ng-3μg 純化模板DNA，RNase-free 水加到滅菌RNase free 1.5ml 離心管中，終
體積為15 μl。
(2) 沸水浴10min后快速置于冰上。
(3) 依次加入下列試劑
(4) 短暫離心，溫和混合，37℃保育1-20h。
*注意：過長時間保育不能增加標記RNA產量
*注意：僅在RNase保護試驗中被要求。
(5) 加65℃溫育10min或加入2μl 0.2M EDTA ( PH 8.0)終止反應。
(6) 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA探針長度。
(7) 探針分裝保存在-20℃備用
*注意：避免探針反復凍融。
三．Northern雜交
1. RNA分離與轉膜
1）材料
注：實驗中所有的試劑的配置都要使用無RNase的水。
（1）10 × BPTE 電泳緩沖液
100mmol/L PIPES (piperazome-1, 4-bis (2-ethanesμlfonic acid)， 哌嗪-, N’
–雙(2-乙磺酸)) ； 300mmol/L Bis-Tris (bis [2-hydroxyethyl] iminotris
[hydroxymethy] methane) ；10mmol/EDTA (pH8.0)；10 × 緩沖液的最終pH 值約為6.5。10 ×
緩沖液的配置:將3g PIPES(游離酸), 6g Bis-Tris (游離堿)，2ml 0.5 mol/L的EDTA (pH8.
0)加到90ml 雙蒸餾水中，在37℃用終濃度為0.1%的DEPC處理1h，然后高壓滅菌
（2）乙二醛
商業儲存的乙二醛溶液(40%或6mol/L)含有各種水合形式的乙二醛,一些氧化產物，如乙二醛酸、蟻酸及一些能降解RNA的化合物，因此必須去除這些雜質。
（3）乙二醛反應混合物
6 ml DMSO，2 ml 去離子乙二醛，1.2 ml 10 × BPTE 電泳緩沖液，0.2 ml 溴乙錠 （10mg/ml 水溶液），分裝成小份，貯存于-70℃。
2）方法
電泳分離RNA：
(1) 配置乙二醛變性反應液。在無菌離心管中混合：
RNA（總共 10 μg） 1 ~ 2 μl乙二醛反應混合液 10 μl每個電泳泳道中可分析10μg RNA。用Northern法可分析10μg
總細胞RNA 即可檢測到其中的大量mRNA。要檢測到稀有RNA則需要至少1.0μg poly（A）+
RNA。RNA相對分子質量標準參照物應當像待側樣品一樣的乙二醛反應液中制備。
(2) 蓋上離心管的蓋子。將RNA 溶液在55℃放置60 min，在冰水中冰浴10 min，然后離心5s，使所有液體沉到離心管底部。
(3) 在樣品加熱過程中，將瓊脂糖凝膠裝到水平電泳儀的盒子中。加入足夠的1×BPTE電泳緩沖液，使其沒過凝膠約1 mmol/L。