試驗程序
1.在純凈工作臺上將5ml含AP的LB液體培養基加入到一10~15ml通氣良好的試管中，然后將前述經鑒定含有目的 DNA片斷的轉化細菌接種其中，37℃下振蕩培養過夜。
2.取1.5ml培養物置于一微量離心管中，在4℃下12000rpm離心2min.，棄去上清液，使細菌沉淀盡可能干燥。
3.將細菌沉淀重懸于100μl溶液I中，劇烈振蕩后加入200μl新配制的溶液II，蓋緊離心管口，將其快速顛倒5次（切勿振蕩），再加入150μl在冰上預冷的溶液III，蓋緊離心管口，將其倒置后輕輕地振蕩使溶液III在粘稠的裂解物中分散均勻，再將離心管置于冰上3~5min.。
4.在4℃下12000rpm離心5min.，將上清液移至另一離心管中。
5.加入等量酚∶氯仿（1∶1），振蕩混勻，在4℃下12000rpm離心2min.，將上清液轉入另一離心管中。
6.加入二倍體積95%乙醇，振蕩混勻，室溫放置20min.，在 4℃下12000rpm離心5min.，小心棄去上清液，倒置將液滴除盡。
7.用70%乙醇洗滌一次，室溫干燥10min.，用50μl含 20μg/ml胰RNA酶（無DNA酶）的TE重新溶解質粒DNA，取1μl 在含溴化乙錠的微型膠上進行電泳檢測，其余置于-20℃保存備用。
B. 質粒DNA的線性化
試劑及其配制
Not I和Sal I內切酶及其相應的緩沖液
酚∶氯仿（1∶1）
3mol/L NaAc(pH 5.2)
100%和70% 乙醇
DEPC-H2O
試驗程序
Sal I或Not I 2μl(10U/μl)
2.37℃保溫反應2小時以上。
3.消化液用100μl的酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm離心5min.
4.將上清液轉入一新的離心管中，加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉和2倍體積乙醇沉淀過夜。
5.4℃下12000rpm離心20min.，棄去上清液，沉淀用70%乙醇洗滌一次，真空干燥。
6.線性化質粒DNA按 0.25μg/μl的濃度重懸于DEPC-H2O中，取10μl電泳檢測線性化質量，其余于-20℃下保存備用。
五、RNA探針制備（根據the DIG system user's guide）
A. 地高辛標記的體外轉錄
試劑及其配制（試劑盒提供）：
10× NTP標記混合物：in Tris-HCl (pH 7.5)
10mmol ATP
10mmol CTP
10mmol GTP
6.5mmol UTP
3.5mmol DIG-UTP
10× 轉錄緩沖液：400mmol Tris-HCl(pH 8.0)
60mmol MgCl2
100mmol DTE(dithioerythritol)
20mmol亞精胺
100mmol NaCl
1unit/mlRNase抑制劑。
10unit/μl DNase I (RNase-free)
20unit/μl Rnase抑制劑
20unit/μl T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶
4mol/L LiCl
200mmol/L EDTA
DMPC-H2O
試驗程序（帶手套操作）
1.在一經DMPC處理并高壓滅菌的無Rnase污染的微型離心管中依次加入下列反應物（離心管置于冰上）：線性化模板DNA 4μl(1μg)
10×NTP標記混合物 2μl
10×轉錄緩沖液 2μl
DMPC－H2O 10μl
T3或T7 RNA聚合酶 2μl
2.輕輕混勻反應物，37℃保溫反應至少2小時。
3.如果必要，向反應體系中加入 2μl無Rnase污染的DnaseI，37℃下再保溫反應15min.以除去殘留的DNA模板（由于DIG標記的RNA轉錄量大大超過DNA模板量，因此，這一步有時也可以省略）。
4.向反應體系中加入2μl 200mmol/L的EDTA終止轉錄反應。
5.再向反應體系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀過夜
6.4℃下，12000rpm離心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗滌一次，真空干燥。
7.沉淀按1μg/10μl的濃度重懸于DEPC-H2O中（每一反應體系約10μg），并向其中加入 20unit Rnase抑制劑，置于-20℃保存備測，檢測后按一次雜交使用的體積分裝再置于-70℃下保存。
DIG標記的RNA在-70℃條件下可以穩定地保存至少1年。
B. DIG標記有效性檢測
RNA轉錄物能通過瓊脂糖變性膠電泳檢測其探針完整性。標記效果可通過抗DIG堿性磷酸酶直接檢測，有兩種方法可以選擇。
方法一、用標準DIG測試條比較鑒定
使用測試條鑒定包括兩個步驟：首先，將轉錄標記的RNA稀釋成一系列的濃度，并點樣到空白測試條上（對照測試條已用一系列濃度點樣）；其次，將點樣的備測試條與對照測試條一起進行免疫、顯色反應，然后根據對照測試條計算備測樣品的濃度。
試劑及其配制
20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L)
0.3mol/L 檸檬酸三鈉?2H2O(88g/L)
pH 7.0
RNA稀釋緩沖液：DMPC-H2O/20×SSC/甲醛(5:3:2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中
BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中
DIG空白試劑條：帶正電荷的尼龍膜
對照試劑條：在相同膜上已用不同濃度的DIG標記DNA點樣（300,100,30,10,3pg）
洗膜緩沖液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid緩沖液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封閉液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na2HPO4
8mmol/L NaH2PO4
室溫保存，如果需要，用0.45μm的濾膜過濾除菌。
檢測緩沖液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE緩沖液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA
試驗程序（帶手套操作）
1.將轉錄反應物稀釋成濃度約為1μg/ml，即取前述轉錄標記物1μl加入99μlRNA稀釋緩沖液，如果轉錄標記反應正常其濃度應大約為1μg/ml。
2.取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E順序編號，將1μg/ml濃度的RNA標記物按下列方式稀釋成一系列濃度：
編號 RNA標記物稀釋方法 RNA終濃度
A 1μg/mlRNA 10μl＋RNA稀釋緩沖液23μl 300pg/μl
B 1μg/mlRNA 5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 100pg/μl
C A 5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 30 pg/μl
D B 5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 10pg/μl
E C5μl + RNA稀釋緩沖液45μl 3 pg/μl
3.將空白測試條置于一聚酯膜上，以每一濃度1μl的量在測試條上點樣，在聚酯膜上做好點樣濃度標記，切勿直接在測試條上做任何記號，切勿用手接觸測試條。
4.室溫干燥約2min.，同時制備測試溶液。
5.在2ml 封閉液中加入1μl Anti-DIG-AP。
6.顯色底物溶液：在2ml檢測緩沖液中加入9μl NBT溶液和7μl BCIP溶液。
7. 準備5個樣品池（2.5 ~ 5ml容量），1～6順序編號，依次加入2ml以下溶液。
①. 封閉液；
②. 抗體溶液（第5項）；
③. ③④⑤洗膜緩沖液；
④. 檢測緩沖液；
⑤. 顯色底物溶液（第6項）