A． 載體選擇
為了獲得能夠在體外轉錄RNA探針的DNA模板，其克隆載體必須帶有可供選擇的特異轉錄啟動子，同時，為了獲得理想的Northern雜交試驗結果，載體選擇帶有兩種不同類型而方向相反啟動子的載體，以便在RNA探針制備時同時得到兩條鏈的轉錄探針。
常用的這類載體有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).
pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).
PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).
Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).
按照試驗的經濟有效原則，本試驗選用 Bluescript M13-。
B. 目的DNA序列與載體連接
從所建立的cDNA文庫中挑選出帶有目的DNA片斷的克隆，擴增后提取質粒，采用限制性內切酶處理或采用PCR特異擴增的方法分離出目的DNA片斷；采用標準質粒提取方法提取載體質粒（見黃健試驗）。然后按下列程序進行連接。
試劑及其制備
T4 DNA連接酶
連接緩沖液（可直接購買或配制），10X 緩沖液配方為：
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl2
50mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）
ATP 5mmol/L ( 如果直接購買商品緩沖液，有的已加在緩沖液中，但有些需單獨加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (3500~8000均可，在緩沖液中加入2%~3% 的PEG可提高平端連接效率)。
無菌蒸餾水（SDW）
試驗程序
1． 建立以下反應體系（終體積20μl）：
4μl 質粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 連接緩沖液
2μl DNA 連接酶
6μl 無菌蒸餾水
2． 反應管置于15℃條件下保溫反應24小時，65℃加熱10min.終止反應。
3．取5～10μl連接反應物用微型凝膠電泳檢測連接效果，其余反應物于-20℃保存備用。
注意事項
1．保證連接反應中目的DNA與質粒載體的濃度比例在3∶1，因為高濃度的DNA有利于片斷與載體的連接，低濃度的DNA則會增加載體自連。
2．DNA連接酶對溫度敏感，在15℃以上會迅速失活，因此，連接反應的溫度控制必須嚴格。
3．為了保證RNA探針的質量，模板DNA片斷的完整性和純度十分重要，在DNA制備時要嚴格控制。
C．感受態細胞制備（CaCl2法）
試劑及其配制