Northern印跡分析實驗

試劑、試劑盒 瓊脂糖凝膠菌落裂解緩沖液蒸餾水甲醛甲酰胺預雜交 雜交液HotPrime cDNA Labeling Kit礦物油MOPS 緩沖液MOPS乙酸鈉EDTAPCR 緩沖液SSCNaClSDSNaClNaH2PO4[a-32P]dATPLgh Rgh 引物鮭魚精 DNATaq DNA 聚合酶

儀器、耗材 離心機濾紙片增光屏離心管硝酸纖維素膜或尼龍膜移液器閃爍計數器Sephadex G50 柱子單一感光科學成像膠卷熱循環儀 薄壁 PCR 管塑料保鮮膜

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

1.5% 瓊脂糖凝膠，加溴化乙錠

菌落裂解緩沖液（PCR-TRAP Cloning System,GenHunter P404 或 L102)

Denhardt 溶液（500 ml)

Ficoll                                         5 g

聚乙烯吡咯烷酮（PVP)            5 g

BSA(PentaxFractionV)             5 g

蒸餾水                                     加至 500 ml

蒸餾水

12.3mol/L(37%) 甲醛，pH〉4.0

甲酰胺預雜交/雜交液（GenHimterMLl)，如果自己配制，使用下面的方案（500 ml)

20XSSPE                                   125 ml

50XDenhardt 溶液                      50 ml

20%SDS                                     2.5 ml

甲酰胺                                       250 ml

蒸饋水                                        加至 500 ml

混勻后分裝成較小體積，-20°C 保存備用。

HotPrime cDNA Labeling Kit(GenHunterH50)，包括 KlenowDNA 聚合酶（1U/ul)、10X 標記緩沖液、dNTP(—dATP) 或 dNTP(-dCTP)(500umol/L)、中止緩沖液以及蒸餾水

礦物油（可選）

10XMOPS 緩沖液

0.2mol/LMOPS

0.05mol/L 乙酸鈉

0.01mol/LEDTA

10XPCR 緩沖液（RNAspectra Differential Display System，F501-F510&R501-R510,PCR-TRAP Cloning System，GenHunter，P404 或 S201)

20XSSC

3mol/LNaCl

0.3mol/L 檸檬酸三鈉?2 H20

用 1mol/LHC1 調 pH 至 7.0

1XSSC,1g/L SDS

0.25XSSC,1g/L SDS

20XSSPE

3mol/LNaCl

0.1mol/LNaH2PO4(二代鹽）

0.02mol/LEDTA

中止緩沖液（0.lmol/LEDTA,pH8.0)

2. 核酸和寡核苷酸

[a-32P]dATP(3000Ci/umol/L)(1Ci=3.7X1010Bq)

dNTP(250umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHunter P404 或 S501)

Lgh/Rgh 引物（2umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHimter P404 或 L201&L202)

鮭魚精 DNA(GenHunter ML2)

3. 酶和酶緩沖液

Taq DNA 聚合酶（Qiagen201207)

4. 專用設備

離心機

3 mm 濾紙片

增光屏

1.5 ml 離心管

硝酸纖維素膜或尼龍膜

移液器

閃爍計數器

Sephadex G50 柱子（Roche Applied Science 1814419，Indianapolis，IN)

單一感光科學成像膠卷 [推薦 Kodak Biomax MS，No.8715187(Kodak-Eastman，Rochester，NY)]

熱循環儀

0.2 ml 薄壁 PCR 管

可透過紫外線的塑料保鮮膜 [推薦 Glad Cling Wrap(The Glad Products Company，Oakland,CA)]

5. 附加試劑

QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit(Qiagen20021)

二、方法

1.cDNA 探針的產生

（1）在每個克隆平板的底部，為每個待分析的四環素抗性菌落編號（推薦每個平板至少選 5 個）。

（2）在 1.5 ml 離心管中，各分裝 5ul 菌落裂解緩沖液。

（3）用干凈的移液頭挑取每個菌落，盡量不要取太多（通常肉眼可見的很小量就足夠了）。將細胞轉到相應標記的 1.5 ml 離心管中。

（4）將離心管在沸水浴中溫育 10min。

（5）以最大速度在室溫下離心 2 min，以沉淀細胞殘余物。將上清液轉到干凈的 1.5 ml 離心管中，棄去殘余沉淀。

（6）裂解產物立即用于 PCR 分析，或保存在-20°C 備用。

（7）將下列組分加到 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，用來做菌落 PCR(強烈推薦先配制一個核心混合液，含有除了菌落裂解液以外的所有組分，這樣可以將吸取樣品的誤差降至最小）。

蒸餾水                                        10.2ul

10XPCR 緩沖液                           2.0ul

dNTP 混合液（250umol/L)          1.6ul

Lgh 引物                                     2.0ul

Rgh 引物                                    2.0ul

菌落裂解液                                 2.0ul

Taq DNA 聚合酶                         0.2ul

混合均勻，如果需要加入 30ul 礦物油。

（8）按照下列程序設置熱循環儀：94°C 30s → 52°C 40s → 72°C lmin → 30 個循環 → 72°C 5 min(延伸) → 4°C 保溫。

（9）在含有溴化乙錠染料的 1.5% 瓊脂糖凝膠上，將 20ulPCR 產物全部跑電泳。這不僅可以產生 Northern 印跡分析所用的 cDNA 探針，而且還顯示出使用 PCR-TRAP CloningSystem 產生的 cDNA 克隆（見方案 6) 中哪一個含有正確的插入片段。

（10）用 QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit 從瓊脂糖凝膠中純化各條帶。純化片段做模板，用 HotPrime DNA Labeling Kit 產生探針。

（11）如果使用不同的載體進行克隆，要根據廠商的建議產生 Northern 印跡雜交所需的 cDNA 探針。

2.cDNA 探針的標記

（12）如果使用推薦的 HotPrime DNA Labeling Kit，將所有組分完全解凍后，立即置于冰上。

（13）在帶有固定帽（這樣在煮沸過程中管帽不會松動）的 1.5 ml 離心管中，配制下面的反應體系。

蒸餾水                                                  11ul

10X 標記緩沖液                                     3ul

用于標記的 DNA 模板（10~50ng)         7ul

（14）將反應混合液在沸水浴中溫育10 min。

（15）將反應管在冰上迅速冷卻。短暫離心，收集冷凝水。

（16）按照下面的順序加入反應試劑。

dNTP(-dATP)(500umol/L)*                 3ul

[a-32P]dATP(3000Ci/mmol/L)*           5ul

Klenow DNA 聚合酶                           1ul

*如果用 [a-32P]dCTP 代替 [a-32P]dATP, 則用 dNTP(—dCTP) 代替 dNTP(-dATP)。

（17）將混合液在室溫放置 20 min, 然后在 37°C 溫育 10min。

（18）加入中止緩沖液，混勻。

（19）用 Sephadex G50 柱純化標記的探針。用帶有固定帽的 1.5 ml 離心管收集純化的探針。在閃爍計數器中，對 1ul 標記的探針進行計數。對大多數標記的 DNA 探針，一共可以獲得 1000 萬或更多的 cpm。

3. 探針雜交

（20）制備變性瓊脂糖（RNA) 凝膠（包括加樣與電泳條件，以及 RNA 轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜）的方案，在 Ausubel 等（1995) 及 Sambrook 和 Russell(2001) 中都有介紹。

（21）如果預雜交緩沖液保存在-20°C，則在 37°C 解凍 20 min。

（22）在沸水浴中溫育 10 min, 變性鮭魚精 DNA。

（23）在預雜交溶液中加入鮭魚精 DNA(終濃度為 100~200ug/ml)，混勻。

（24）用 5 ml 或足夠董的預雜交溶液將膜覆蓋，在 42°C 下預雜交至少 4 h。

（25）用一個帶有固定帽的 1.5 ml 離心管（否則管帽會松動），在水浴中煮沸10min, 以變性純化的探針。

（26）在冰上冷卻 2 min。

（27）離心甩下冷凝水，將探針直接加到預雜交溶液中。

（28）雜交過夜。

（29）小心地倒出放射性的雜交液，在專門盛放放射性廢液的容器中處理。

（30）在室溫下，用含有1g/LSDS 的 1XSSC 洗滌 2 次。都要在專用的容器中處理洗滌溶液。

（31）用預熱的含有1g/L SDS 的 0.25XSSC，在 50~55°C 下漂洗 15~20 min。

4. 印跡曝光

（32）用 3 mm 的濾紙將膜吸干，并用可透過 UV 的塑料薄膜包起來。

（33）將印跡在帶有強化屏的單色光膠片下曝光，在-70°C 具有最佳的檢測信號。