Northernblot實驗（二）

總RNA樣品或mRNA樣品探針模板DNA(25 ng)尼龍膜

NorthernMax Kit（Cat. # 1940AmbionInc.）瓊脂糖DEPCX光底片底片暗盒Random PrimerdNTP Mixture111 TBq mmol[a-32P]dCTPExo-free Klenow Fragment和10 X BufferSephadex G-50SDS雙氧水滅菌水

恒溫水浴箱電泳儀凝膠成像系統真空轉移儀真空泵UV 交聯儀雜交爐恒溫搖床脫色搖床漩渦振蕩器分光光度計微量移液器電爐（或微波爐）離心管燒杯量筒三角瓶

一、用具的準備
 

1.  180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。
 

2.  電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。
 

3.  處理DEPC水(2 L)備用。
 

二、用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
 

用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。
 

三、制膠
 

1.  稱取0.36 mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4 ml DEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分)。
 

2.  在通風廚中加入3.6 ml的10*Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。
 

注意盡量避免產生氣泡。
 

3.  將熔膠倒入制膠板中，插上梳子
 

如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或將氣泡推到膠的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5 cm。
 

4.  膠在室溫下完全凝固后，將膠轉移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1 cm，小心拔出梳子。（配制250 ml 1*MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補充蒸發的buffer。）
 

5.  檢查點樣孔。
 

四、RNA樣品的制備
 

在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB（終濃度為10 ug/ml）。混勻后，65℃空氣浴15 min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5 min。
 

五、電泳
 

1.  將RNA樣品小心加到點樣孔中。
 

2.  在5 V/cm下跑膠（5ｘ14 cm）。在電泳過程中，每隔30 min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍（500 bp）接近膠的邊緣時終止電泳。
 

3.  紫外燈下，檢驗電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。
 

注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。
 

六、轉膜
 

1.  用3%雙氧水浸泡真空轉移儀后，用DEPC水沖洗。
 

2.  用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。
 

3.  連接真空泵和真空轉移儀，剪取一塊適當大小的膜（膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的5 mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當位置。
 

4.  蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。
 

5.  將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2 mm，以防止漏氣。
 

6.  將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。
 

7.  打開真空泵，使壓強維持在50~58 mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10 min在膠面加上1 ml transfer buffer，真空轉移2小時。
 

8.  轉膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。
 

9.  用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯儀中自動交聯。
 

10.  將膠和紫外交聯后的膜，在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間)。
 

11.  將膜在-20℃保存。
 

七、探針的制備
 

1.  在1.5 ml離心管中配制以下反應液：

模板DNA(25 ng) ：1ul

Random Primer ：2ul

滅菌水： 11ul

總體積：14ul
 

2.  95°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5 min。
 

3.  在離心管中按下列順序加入以下溶液：

10×Buffer ：2.5 ul

dNTP Mixture ：2.5 ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP ：5 ul

Exo-free Klenow Fragment ：1 ul
 

4.  混勻后（25 ul），37°C下反應30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。
 

5.  65°C加熱5 min使酶失活。
 

八、探針的純化及比活性測定
 

1.  準備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的TE（PH7.6）。
 

2.  取1ml一次性注射器，去除內芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
 

3.  將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊后，補加Sephadex G-50凝膠懸液，重復此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度處。
 

4.  100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復3次。
 

5.  倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準1.5ml離心管。
 

6.  將標記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點樣于DE8　paper上，其余上樣于層析柱上。
 

7.  1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣于DE8-paper.
 

8.   測比活性(試劑比活要求:10^₆cpm/ml）。
 

九、預雜交
 

1.  將預雜交液在雜交爐中68℃預熱，并漩渦使未溶解的物質溶解。
 

2.  加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm² 膜面積加入10 mlULRAhyb雜交液)，42℃預雜交4 h。
 

十、探針變性
 

1.  用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
 

2.  90℃熱處理稀釋后探針10 min后，立即放置于冰上5 min。
 

3.  短暫離心，將溶液收集到管底。
 

十一、雜交
 

1.  加入0.5 ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預雜交液中。
 

2.  42℃雜交過夜（14~24 h）。

雜交完后，將雜交液收集起來于－20℃保存。
 

十二、洗膜
 

1.  低嚴緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100 cm²膜面積加入20ml洗膜溶液)，室溫下，搖動洗膜5 min兩次。
 

2.  高嚴緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100 cm²膜面積加入20ml洗膜溶液)，42℃ 搖動洗膜20 min兩次。
 

十三、曝光
 

1.   將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。
 

2.   檢查膜上放射性強度，估計曝光時間。
 

3.  將X光底片覆蓋與膜上，曝光。
 

4.   沖洗X光底片，掃描記錄結果。
 

十四、去除膜上的探針

將200 ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個月。
 

十五、雜交結果
 

操作應該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。