（1）原理：有的細菌可產生β-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黃色的-硝基酚（O-nitrophenol），在很低濃度下也可檢出。
（2）試劑：0.75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸餾水中，在加入緩沖液（6.9gNaH2PO4，溶于45ml蒸餾水中，用30%NaOH調整pH為7.0，再加水至50ml）5ml，置于4℃冰箱中保存。ONPG溶液為無色，如出現黃色，則不應再用。
（3）方法：從培養基上取菌，于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5分鐘，加入0.25ml ONPG試劑，水浴20分鐘～3小時觀察結果。
（4）結果：菌懸液呈現黃色為陽性反應，一般在20～30分鐘內顯色。
（5）應用：迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，而不發酵乳糖的細菌為陰性。本實驗主要用于遲緩發酵乳糖菌株的快速鑒定。