實驗概要
本實驗在生物素標記cRNA片段化的基礎上，提供了小鼠全基因組Oligo芯片的構建及數據分析流程。
實驗步驟
1. 芯片雜交
使用Affmetrix Hybridization Oven 640，先進行Test芯片的雜交、清洗染色、掃描和分析，根據Test芯片的結果再雜交Real芯片。
1) 根據表1配制雜交液(己將雜交過程中會損失部分(10-20ul)考慮在內，例如芯片是49/64 Format，需要配制雜交液300ul)。
2) 輕彈管壁數次使其充分混勻，瞬時離心(約5 sec)收集溶液于管底。
3) 將雜交液置于加熱塊上，99℃溫育5 min。
4) 其間，用一次性吸頭通過芯片上septa注入相應體積1×Hybridization Buffer，將芯片置于雜交爐中，45oC溫育10 min，60 rpm旋轉。
5) 將99℃已溫育5 min的雜交液轉移到另一加熱塊上，45oC溫育5min。
6) 從加熱塊上取出雜交液，微型離心機最大轉速離心5min，以除去雜交混合液中的不溶性雜質。
7) 從雜交爐中取出芯片，吸出1 XHybridization Buffer注入200ul澄清雜交液，不要吸取管底的不溶性物質。
8) 將芯片平衡放置于雜交爐中，45℃，60 rpm旋轉雜交16h，進行下一步。
2. 芯片清洗染色
使用A偽metrix Fluidics Station 450進行芯片洗染:
1) 取1.5 ml EP管，按照表2配制SAPE Stain Solution，充分混勻，瞬時離心(約5 sec)收集溶液于管底，取600ul到另一1:5 ml EP管中。
2) 取1.5 ml EP管，按照表3配制Antibody Solution，充分混勻，瞬時離心(約5 sec)收集溶液于管底。
3) 雜交結束后，吸走雜交液，注入200ul Non-Stringent Wash Buffer(Wash Buffer A)。
4) 在GCOS軟件中運行程序‘`EukGE-WS2v5"，開始芯片清洗染色。
3. 芯片掃描
使用Affymetrix Scanner 3000對芯片進行掃描，得到熒光信號圖像。
4. 數據分析
使用Affymetrix軟件系統GeneChip Operating software (GCOS 4.0)對芯片圖像進行數據提取，得到.DAT, .CEL, .CHP和.RPT文件。
1) 數據預處理
通過扣除背景值和噪聲修正，對數據進行預處理得到信號值。
2) 基因表達的判別
基因是否表達主要是根據PM和MM強度差異的相對指標予以判定的。對于第i個probe pair:
Ri分布在0-1之間，當Ri越接近于1, PM和MM的差異越顯著。對于每一個probe
set的11對probe的Ri值，采用(單側)Wilcoxon's ranktest計算p值，根據p值判斷基因是否表達。當p<0.04,
PM和MM探針有顯著性差異，基因表達，判定為“P";當p>0.06,
PM和MM探針沒有顯著性差異，基因不表達，判定為“A"，如果0.04印<0.06，基因表達的判定處于臨界狀態，判定為“M"(如圖所示):
3) 差異表達基因的篩選
將GeneChip Operating software (GCOS 1.4)得到的原始信號值，用dChip
software進行不變集非線性歸一化;用SAM軟件分別篩選MT /
小鼠和MT-/-小鼠DOX給藥前后的變化基因，按照q-value(%)<5%的標準，把ratio
>2的基因認為是DOX給藥后發生上調改變的基因，ratio<0.5的基因認為是DOX給藥后發生下調改變的基因;篩選出差異表達基因用于生物信息學分析。各組間相互比較示意圖見圖，箭頭的末端為每個兩兩分析中的參照。
4) 聚類分析
使用cluster 3.0軟件對進行SAM軟件篩選后的基因的信號值進行非監督聚類分析。
5) 差異表達基因的生物信息學分析
使用在線檢索數據庫對篩選出的差異表達基因進行生物信息學分析。該檢索系統整合了包括Unigene, Locus link, OMIM,NCBI dbEST, NCBI CDD在內的多種公開數據庫，并且提供Gene Ontology和Pathways (KEGG} Genmapp and Biocarta)分析。