OmegaSE血液DNA提取技術

實驗概要

OmegaSE血液DNA提取試劑盒說明書(E.Z.N.A. SE Blood DNA Kit)。

主要試劑

1. 用dd H₂O稀釋ERLBuffer(10×)。

2. 用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。

    D3471-00：加入27 ml dd H₂O    D3471-00：加入8ml無水乙醇

    D3471-01：加入225 ml dd H₂O   D3471-01：每瓶加入80ml無水乙醇

    D3471-02：加入630 ml dd H₂O   D3471-02：每瓶加入80ml無水乙醇

3. 可選：蛋白酶K ( 20 mg / ml )。

主要設備

1. 臺式離心機(微量離心機至少13，000 xg；15 ml臺式離心機轉子能力須達到2，000 xg)；

2. 無核酸酶2 ml、1.5 ml離心管；

3. 水浴鍋：65℃；

4. 培養箱：37℃。

實驗步驟

1. S E血液DNA提取試劑盒操作步驟(不多于300 ul全血)

    1) 將樣品加至2 ml離心管，加3倍體積ERLBuffer，混勻，室溫放置5 min，放置時適當搖勻。(注意：ERLBuffer必須稀釋后才能用)

    2) 室溫14， 000 xg離心30 s，在不打散白色沉淀的情況下去除上清，剩余10 ul左右。如果血液樣品是冰凍的，重復操作步驟1 - 2直至沉淀為白色。(如果白細胞沉淀上仍有一些紅細胞或細胞殘質，可加2體積的E R L混勻，室溫放置2 min，進行步驟2至沉淀為白細胞沉淀。

    3) 振蕩離心管重懸白細胞沉淀，加入240 ul WTLbuffer，高速振蕩30 s裂解細胞，溶液變得粘稠，如果溶液混勻后仍有明顯凝塊存在可放在37℃水浴直至其消失。

    4) (建議)加3 u l蛋白酶K，混勻，放于55℃水浴10-30 min。

    5) 加入2ul Rnase A溶液混勻，室溫放置10 min。

    6) 加入250 ul Buffer Bl，振蕩混勻，65℃10 min，在此期間混勻2次。

    7) 加250 ul無水乙醇，振蕩完全混勻。如果出現可見顆粒，上下搖晃10次。

    8) 把HiBind DNA柱套在2 ml收集管中(已提供)，將第七步得到的溶液全部轉入柱中，大于8，000 xg離心1 min，棄去濾液

    9) 把柱子裝在新收集管中，加入500 ul HBuffer，按上述條件離心，棄去濾液。

    10) 把柱子裝回收集管中，加入650 ul DNA Wash Buffer (含乙醇)，按上述條件離心，棄去濾液。

注意：濃縮的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋。如果放入冰箱中，使用前須恢復到室溫。

    11) 把柱子裝在新收集管中，加650 ul DNA Wash Buffer，按上述條件離心，棄去濾液。

    12) 棄去濾液，把柱子裝回收集管，最高速(大于13，000 xg )離心空柱2 min以干燥柱子基質。

注意：不要忽略此步――這對從柱子上除去乙醇至關重要。

    13) 把柱子裝在干凈的1.5 ml離心管上，加入50-100 ul 70℃預熱的Elution Buffer到柱子中央。室溫靜置5 min。

    1 4) 室溫下，10，000 xg離心1 min以洗脫DNA。

    1 5) (可選)將柱子置于另一干凈的1.5 ml離心管上，重復步驟13)-14)以洗脫殘留在柱子上的DNA。

2. SE血液DNA提取試劑盒操作步驟( 400 ul -1 ml全血)

    1) 將少于1 ml樣品加至15 ml離心管，加3倍體積1×ERLBuffer，混勻，室溫放置5 min ，放置時適當搖勻。(注意：ERLBuffer必須稀釋后才能用)

    2) 室溫2，000 xg離心5 min，在不打散白色沉淀的情況下去除上清，剩余20 ul左右。如果血液樣品是冰凍的，重復操作步驟1)-2)直至沉淀為白色。(如果白細胞沉淀上仍有一些紅細胞或細胞殘質，可加2體積的ERLBuffer混勻，室溫放置2 min，進行步驟2)至沉淀為白細胞沉淀。

    3) 振蕩離心管重懸白細胞沉淀，加入230 ul WTLbuffer，高速振蕩30 s裂解細胞，溶液變得粘稠，如果溶液混勻后仍有明顯凝塊存在可放在37℃水浴直至其消失。

    4) (建議)加3 ul蛋白酶K，混勻，放于55℃水浴30 min。

    5) 加入2 ul Rnase A溶液混勻，室溫放置10 min。

    6) 加入250 ul BufferBl，振蕩混勻，65℃放置10 min，在此期間混勻2次。

    7) 加250 ul無水乙醇，振蕩完全混勻。如果出現可見顆粒，上下搖晃10次。

    8) 重復1方案步驟8)-15)。