Orbitrap質譜蛋白質組沙龍在京舉行

　　【導語】使用質譜儀器進行蛋白質組研究中有三個關鍵環節，第一個是樣品的處理階段，這是最簡單，也是最重要的一個步驟。第二個階段是儀器的操作部分，使用液相、質譜等儀器把蛋白質進行分離、分析。主要涉及儀器參數的優化調整。第三步是生物信息學分析部分，這也是最難的部分。本期沙龍中中科院生物物理所的薛鵬老師和醫科院基礎所的孫偉老師分別從樣品制備環節和儀器參數調整兩個方面介紹了工作中的一些經驗。

　　2012年4月21日，由中國醫學科學院基礎醫學研究所、賽默飛世爾科技、分析測試百科網共同發起、策劃，組織的蛋白質組學沙龍在中國醫學科學院基礎醫學研究所老樓外賓室舉行。本次沙龍主要圍繞蛋白質組領域，來自中國科學院系統、國家食品安全風險評估中心、北京出入境檢驗檢疫局、軍事醫學科學院等一線科研人員、以及賽默飛世爾科技的技術工程師近30人參加了本次沙龍活動。

沙龍現場

　　中國醫學科學院基礎醫學研究所中心實驗室的孫偉老師首先介紹了本期沙龍舉辦的情況。孫老師講到，之前AB SCIEX公司和二炮醫院一起組織了一個質譜沙龍，主要關注研究小分子的藥物和代謝領域。中國醫學科學院基礎醫學研究所和賽默飛世爾科技合辦的質譜沙龍主要關注蛋白質組領域。目前在蛋白質組研究領域中召開的很多會議，報告很少涉及儀器使用和應用。建立這個質譜沙龍的初衷就是為從事質譜工作的一線實驗人員提供一個平臺，可以共同交流討論操作儀器的問題和經驗。給大家工作中有所提示，達到相互借鑒的目的。本次沙龍主要圍繞蛋白質組研究，今后還有食品和農業領域、最新儀器/技術、藥物研發及檢測方面的多期沙龍活動。孫老師歡迎大家今后多多參與，共同討論質譜儀器研究中的問題和心得。

　　在使用質譜儀器進行蛋白質組研究中有三個關鍵環節，第一個是樣品的處理階段，這是最簡單，也是最重要的一個步驟。第二個階段是儀器的操作部分，使用液相、質譜等儀器把蛋白質進行分離、分析。主要涉及儀器參數的優化調整，第三步是生物信息學分析部分，這也是最難的部分。本期沙龍中中科院生物物理所的薛鵬老師和醫科院基礎所的孫偉老師分別從樣品制備環節和儀器參數調整兩個方面介紹了工作中的一些經驗。

中科院生物物理所 薛鵬老師

　　薛鵬老師帶來的報告題目是《超濾輔助的順序酶切樣品制備方法》。

　　薛鵬老師來自中科院蛋白質組學技術實驗室，為中科院生物物理研究所和北京生命科學大型儀器區域中心管理委員會下屬眾多實驗室之一。實驗室成立于2004年，歷經一期建設、二期建設。目前實驗室擁有雙向電泳系統、Typhoon scanner、LTQ LC/MS、MALDI TOF、全自動斑點處理工作站、Sequest cluster等儀器，二期建設后增加一些高性能的儀器，有TSQ vantage LC/MS、LTQ Orbitrap XL LC/MS、6460 Triple Quad LC/MS、6530 Q-TOF LC/MS、PA 800plus毛細管電泳、6110 Single Quadrupole LC/MS。實驗中心有完善的儀器管理系統，用戶流程和操作員流程簡單明了。主機房中前兆交換機保證了信息化系統的安全快速。薛鵬老師所在的蛋白質組學技術實驗室不僅擁有多臺大型儀器，同時實驗室還根據實驗需要自主開發和改進儀器。比如高靈敏度高通量和高效多維蛋白質鑒定系統SCX-C18，自主填料的nano色譜柱，填料到達了柱子尖端減少了檢測器的擴散。

　　薛老師介紹了他近期的工作：超濾輔助的順序酶切樣品制備方法。這是因為orbitrap多肽鑒定的分子量分布與實際酶切多肽分子量分布的不一致。這和質譜的靈敏度和結果檢索算法的特性有關。實際中可以檢測的分子量范圍位于700-3000。為了提高靈敏度，增加檢測的蛋白質數量，實驗中要使用酶切的方法。基本想法是低端的使用一個長的酶切變成一個高的分子量后分離檢索，高端的使用另一個酶切變成低分子量來檢索。薛老師設計的超濾輔助順序酶切的基本技術路線就是使用膜過濾的三步酶切法：樣品使用Lus-c酶切上質譜，過膜后用Trupsin酶切再上質譜，過膜后第三步使用GLU-C酶切上質譜。對比實驗中直接使用Trupsin酶切三遍不過膜直接上質譜。

三步酶切法

對比實驗

　　在檢測中，薛老師也進行了一些改進，在長分析柱的一維LC/MS檢測中，分析柱的內徑從100u改為75u，長度由10cm增加到20cm;流速從500nl降到300nl;TRAP柱放在分析柱前，減少和分析柱之間死體積。在多維檢測中，除了分析柱內徑和長度、泵的流速同樣變化外，同時新增自動進樣器進樣功能使用兩個切換閥，為了保持鹽洗脫時SCX柱的最佳流速1-1.2ul，使用了5cm長度的C18trap柱。實驗結束可以看到，使用順序酶切后獲得的蛋白有6357，而Trupsin3次重復酶切只得到5950個蛋白。在多維檢測中，順序酶切多肽數目達到47257，三次Trupsin酶切得到35135個，數量差別就比較大。

　　把超濾輔助的順序酶切方法用于磷酸化組學中，使用LysC、Trypsin、GluC酶切可以得到總的磷酸化位點達到4000多個。因此薛老師認為超濾輔助的順序酶切蛋白質組學樣品制備方法能有效提高蛋白質組和磷酸化蛋白質組的覆蓋率。

　　最后薛老師和大家分享了磷酸化實驗MSA的一些經驗。

醫科院基礎所 孫偉老師

　　孫偉老師報告的題目是《Orbitrap高分辨質譜儀在尿蛋白質組上的應用》。孫老師首先介紹了醫科院基礎所質譜中心的發展歷史。2002年到2006年，醫科院基礎所的蛋白質組學中心建在亦莊，是國內研究蛋白質組比較早的實驗室，當時實驗中心的質譜儀器只有賽默飛世爾科技的一臺LCQ DECA XP+和一臺AB SCIEX的Voyanger。2007年搬到了現在的東單醫科院基礎所的質譜中心，目前已經擁有4臺質譜儀和5臺液相色譜，有賽默飛世爾科技的LTQ XL和LTQ Orbitrap Velos，布魯克公司的UltraflexExtreme MALDI TOF/TOF，AB SCIEX 公司的5600 Triple TOF等。質譜中心主要從事蛋白質組方面的研究，除了自身科研外，也為醫科院和外部實驗室科學研究提供平臺進行檢測和方法開發。

　　孫偉老師介紹來了LTQ Velos Orbitrap中比較重要的是s-lens設計、雙壓離子阱設計。S-lens雙內徑可變間距透鏡傳輸系統，增加離子聚焦功能，離子強度比XL要增加一個數量級，靈敏度高;2個離子阱明顯增加掃描速度。2009年Olsen發表論文：LTQ Orbitrap Velos和LTQ Orbitrap XL進行BSA肽鑒定比較，Velos鑒定結果比XL好，濃度越高，差別越小，當BSA濃度很低時，XL鑒定出的肽數量和Velos差距很大。

　　隨后孫老師從自身工作出發，介紹了購買儀器后，前期所做的優化和測試。主要包括動態排除，電荷狀態，MS/MS數目，分辨率，窗口寬度，污染。

　　動態排除是鑒定過程常用的一個方法。在1個小時的梯度時間內，把動態排除時間分別設置不同數值，測試可鑒定出的蛋白數量，實驗結果顯示15s時鑒定出的蛋白數量最多，可以得到的譜圖數和總譜圖數也是最多的，譜圖的利用率也很高。因此試驗中設定動態排除時間為15s。孫老師強調動態排除時間和半峰寬有關，因此實際工作中需要考慮色譜和樣品的因素。

　　Orbitrap儀器可以測出電荷狀態，因此電荷狀態的設定也是一個因素，樣品處理情況和后期的結果處理軟件也影響到電荷狀態。肽一般帶兩個電荷，考慮現在的生物學信息軟件也不合適分析高電荷，試驗中一般設定2個電荷。

　　做一級質譜分析的時候，儀器使用不同分辨率鑒定出的蛋白質沒有很大差別。實驗中一般選擇分辨率30000。做二級質譜分析時，窗口寬度一般需要設定，會對結果產生一定影響。使用一個標準品從1-5分別設定進行實驗，一般使用2.5。但在復雜樣品分析時，窗口放寬會出現共洗脫峰出現。

　　孫老師重點介紹了污染的影響，Orbitrap由于s-lens設計使得進入四級桿的離子數量增多，靈敏度增加，但同時也增加了污染的機會。所以孫老師建議出現污染后需要把s-lens、四級桿都清洗一遍。

　　目前國外實驗室經常有實驗室對比，孫老師也希望大家能夠使用同一樣品在不同的儀器平臺上進行對比，比較結果希望對應用有所幫助，對今后的實驗有所借鑒。

　　最后大家一起參觀了醫科院基礎所的質譜中心實驗室。

Orbitrap質譜蛋白質組沙龍與會者合影

醫科院基礎所質譜中心實驗室儀器