PCR產物的電泳鑒定

一、準備工作

1、實驗器具與材料：

（1）移液槍：10ul

（2）吸頭：20ul

（3）吸頭臺：放置200ul和20ul的吸頭一個

（4）三角燒瓶：50ml一個

（5）瓊脂糖

2、實驗器具的處理與準備

（1） 塑料制品：（包括吸頭等）

送至高壓3次，試驗前將槍頭放入吸頭臺。

（2）電泳板及電泳槽：

用自來水沖洗干凈備用

3、試劑配制和準備：

（1） 電泳緩沖液（TAE）：

先配制0.5mol/L，PH8.0的EDTA溶液：將37.2g EDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌。在用NaOH調節溶液PH值至8.0（約需4gNaOH）。用蒸餾水定容至200ml。后送至高壓滅菌。室溫保存。

再配制50×TAE溶液：在400ml蒸餾水中溶解121g Tris堿，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸餾水定容至500ml，室溫保存。

（2）瓊脂糖溶液（1.0%）：

50×TAE溶液取10ml，稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至60℃左右時加入10mg/ml EB 5ul，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置45min左右后進行電泳。

（3）溴化乙錠（EB）（10mg/ml）：

在20ml水中加入0.2g溴化乙錠，磁力攪拌數小時。然后用鋁箔包裹容器或將溶液轉移至棕色瓶中，室溫保存。

（4）加樣緩沖液（Loading Buffer）一般為6×Loading Buffer

二、電泳鑒定時注意事項：

佩戴一次性手套，避免皮膚接觸EB。無路做膠還是電泳緩沖液盡量用新的，不要超過兩周。

三、電泳步驟

1、50×TAE取10ml稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖。電爐上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入電泳槽中。

2、用透明膠封閉電泳板，瓊脂糖溶液冷卻至溫熱時，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后，拔出梳子，放入電泳槽中。

3、加樣：PCR Marker：1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE混勻于塑料膜上，加入孔中。PCR樣品：5ul 樣品DNA+1ul Loading Buffer 混勻后依次加入孔中。

4、接上電源，電壓120V，電流50mA進行電泳。

5、電泳約1小時后，紫外燈檢測。