PCR假陰性問題總結

PCR的假陽性問題深受重視，但PCR假陰性問題相對于臨床檢測更為嚴重。其實PCR假陽性的問題是比較單純的，一般僅涉及污染和引物的非特異性問題。而污染可以通過嚴格的實驗室管理，合理的環境設置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解決，而引物的非特異性問題基本屬于廠家試劑質量問題。而PCR的假陰性卻不同，它涉及了與PCR實驗的幾乎所有人員和技術環節，十分復雜。就臨床而言，大三陽檢出率低、甚至于GC鏡下都很多時，PCR仍為陰性的事情也經常發生，可見假陰性問題的嚴重性。

就PCR假陰性問題總體來說有如下因素：

一、儀器因素

PCR實驗對儀器的依賴性是很高的，離心機、擴增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴增儀的主要問題是孔間差，引起擴增失敗可擴增效率降低。而離心機的影響則更容易被忽視。國內使用離心機很少使用離心加速度（XXXg）作為參數指標，而常使用轉數作為參數指標，這里就存在著一個問題，由于離心機的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉速所產生的離心力相差很大(有的在數倍以上)，所以在相同的離心時間下，有可能模板并沒有離心下來，造成PCR假陰性。這個問題在其他實驗也有，但因基他實驗都是測定大分子蛋白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機的實驗要注意一下這個問題。

二、試劑質量問題

PCR實驗的成功與否試劑的質量至關重要，試劑的質量問題涉及多個方面：細胞的裂解；模板的抽提；引物位點的選擇；Taq酶的活性等等。其中任一環節出了問題都會引起結果的假陰性。這些都是試劑質量的問題，因此選用高質量的PCR試劑非常重要。

三、核酸模板問題

核酸模板質量問題是制約PCRzui重要的因素之一。核酸模板在擴增區出現斷裂、蛋白粘附、空間位阻等模板質量問題都有可能引起擴增失敗造成結果的假陰性或定量不準確。由于無論什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板質量雖然與試劑的質量有關，但它不可能由試劑質量完全解決。

核酸模板問題除了模板本身的問題外，還存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分（如某些蛋白、離子等）作用，而導致擴增效率降低甚至擴增失敗的問題。對此，有人提倡進行模板純化，效果較為明顯。但另一個問題又出現了，那就是怎樣保證純化的回收率問題。總之，核酸模板問題是不可避免的問題，只能努力去減少。

四、操作人員素質問題

PCR實驗的環節很多，而且對每一環節的質量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環參數設計錯誤、對于RNA抽提降解、逆轉錄失敗等等都能造成結果的假陰性。因此要求PCR的實驗操作人員有很好的素質，能夠嚴格遵守操作規程，并能敏銳的發現問題和解決問題。

五、其他

PCR實驗中從樣品的采集、運輸、保存開始就可以引起結果的假陰性，而對于病原體檢測（如HBV）在人體血液系統出現有周期性變化也是值得注意的因素。