PCR反應體系和條件(三)

PCR技術概論  
   聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

 PCR技術簡史  
PCR的zui早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年zui早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。
PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善　Mulliszui初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

 PCR技術基本原理  
PCR技術的基本原理　類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。
PCR的反應動力學　 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應zui終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。
PCR擴增產物 　可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在*個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。