PCR反應條件的調節

1、 溫度與時間的設置：

基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq dna酶仍有較高的催化活性)。

1. 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的zui主要原因。DNA在其鏈分解溫度時的變性只需幾秒鐘,但反應管內達到Tss還需一定時間,變性溫度太高會影響酶活性;通常情況下93℃～94℃1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。變性所需的加熱溫度取決于模板及PCR產物雙鏈DNA中的G+C含量。雙鏈DNA中的G+C的比率越高，則雙鏈DNA分離變性的溫度也就越高。變性所需的時間與DNA分子的長度相關，DNA分子越長，在特定的變性溫度下使雙鏈DNA分子完全分離所需的時間就越長。若變性溫度太低或變性時間太短，則只能使DNA模板中富含AT的區域產生變性，當PCR循環中的反應溫度降低時，部分變性的DNA模板又重新結合成雙鏈DNA，從而導致PCR的失敗。

2. 退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。復性溫度決定著PCR的特異性.引物復性所需的溫度與時間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。一般退火溫度在40～60℃之間，時間為30～45s，足以使引物與模板之間完全結合。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇zui適退火溫度的起點較為理想。如果(G C)低于50%，退火溫度應低于55℃。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T) 復性溫度=Tm值-(5～10℃)

【引物長度在15～25bp可通過公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃計算退火溫度】:

較高的退火溫度可提高反應的特異性。在Tm值允許范圍內，應盡量選擇較高的復性溫度。

3. 延伸溫度與時間：Taq dna聚合酶的生物學活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子;70℃ 60核苷酸/S/酶分子;55℃ 24核苷酸/S/酶分子;高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

延伸溫度應在Taq酶的zui適溫度范圍之內，一般在70～75℃。常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸時間要根據DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定，通常對于1kb以內的片段1min是夠用的。3～4kb的靶序列需3～4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

2、 循環數：

循環次數決定著擴增的程度。在其它參數都已優化的前提下，循環次數取決于zui初靶分子的濃度。循環次數過多會增加非特異性產物量及堿基錯配數，此外還會導致PCR反應“平臺效應”的出現;循環數太少會影響正常的PCR產物量。常規PCR一般為25-40周期較合適，具體要多少循環數可通過預試驗確定。在其他參數交已優化的條件下，zui適循環數取決于靶序列的初始濃度，模板DNA分子數 需要熱循環次數參照：

3.0×105 25-30

1.5×104 30-35

1.0×103 35-40

50 40-45

3、 PCR產物積累規律：

反應初期產物以2n呈指數形式增加，至一定的循環數后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產物進入一個緩慢增長時期(“停滯效應”)，即“平臺期”。到達平臺期所需PCR循環數與模板量、PCR擴增效率、聚合酶種類、非特異產物竟爭有關.