PCR在臨床檢驗中的應用（二）

     呼吸系統感染性疾病主要的有肺結核、非典型性肺炎等。結核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結核病的預防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現，使結核病流行基本被控制。近來結核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現，其二是對結核預防重視不足。結核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應易出現假陽性，結核檢測的金標準是結核菌培養法。但培養法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應用中受到限制。PCR在結核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優點。一般認為樣本中內要有100個左右的結核菌即可被檢出。目前用于結核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設計的引物擴增產物為245BP，研究表明這一基因對人型結核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因對人型結核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結核菌痰標本的PCR檢測應注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關。這種擴增結果的判斷應特別注意，凡在陽性對照相應位置有明顯條帶的判陽性，否則應為陰性，或建議病人過一些時間后再復檢一次；其二，結核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至會導致嚴重非特異性擴增，電泳結果呈霧狀；基三，結核痰樣本PCR檢測結果可能表現為陽性、陰性交替出現，這與結核病灶的不規律排菌有關。

    循環系統以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經腸道粘膜、淋巴結進入血液，最終可定位于心肌細胞中導致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應注意樣本的保存。外在環境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

    PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應用。經典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經系統。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質粒設計的引物敏感性高但偶爾出現多條帶的擴增產物，判斷結果時應以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關系并不密切，經常有交叉或多型民時感染。為簡化操作，對其基因對比分析尋找共同序列設計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。