1、測定分析前的污染源
測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。
2、測定分析階段的污染源
通常,測定分析階段的每一步都可能發生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白,明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應管,吸頭)和實驗設備(如加樣器、離心機)等。
在前面三個工作區中,不當的實驗操作會引起所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區,當吸取擴增產物用于檢測時,非常容易引起污染,因此必須制定標準操作程序(SOP),并嚴格執行。
3、污染的避免
要避免污染,首先應是預防而不是排除污染,前面所述對工作區的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。
為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染,可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP,使得產生的特異擴增片段含有尿嘧啶,這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG),可破壞來自以前測定的擴增產物,從而避免其對以后要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續的長波紫外燈照射,通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物,由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程,所以這種方法也能防止污染。
上述防污染方法只在一定程度上有效,所以不能用其來替代嚴格的實驗室設置和管理,尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。
4、去除污染的措施
工作完后必須定期對實驗室采取有效的去污染措施,結合各種不同的方法可達到最佳效果。
去污染措施包括但不僅限下面幾種:(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面;(2)試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面;(3)實驗設備如加樣器的高壓消毒。