實驗目的
為了獲得大量的AKP基因，我們需要將目的基因通過PCR擴增基因劑量，方便下一步實驗作基因重組。
我們需要注意PCR產物的準確性和產率。特別注意引物、復性溫度、TaqE對準確性的影響和延伸時間（1000bp/min）、Mg2+濃度、循環數（小于等于30）對產率的影響。
同時，我們要掌握PCR基因擴增及擴增產物的回收的基本原理和實驗技術方法。
實驗原理及過程
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實驗步驟 |
實驗原理 |
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1 PCR體系的準備和PCR擴增的開始 |
2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0uL
10xbuffer Mg2+ Ex－TaqE ddH2O 40uL primer 4uL 模板DNA 2uL 940C,2’ 940C 1’ 420C 1’ 720C 2’ 720C 10’ I-------30cycles----I |
聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，即PCR技術。 在合適條件下，這種循環不斷重復，前一個循環的產物可作為后一循環的模板參與DNA的合成，最終使產物DNA的量按2n方式擴增。 理論上講經過30次的循環反應，DNA擴增倍數為106-109。
PCR引物的設計至關重要，3’端要嚴格配對，5’可以引入酶切位點，也可以由此控制Tm值和CG的比值。 TaqE有最適溫度和反應的活性，要注意它有加尾活性。 循環數超過30個以后，因為產物數量增加和反應物數量的減少，反應速度降低，這時對反映的產率已經沒有貢獻，反而副產物增多,影響效果。所以，循環數不應超過30。 |
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2 PCR產物電泳 |
0.8 %Agarose（1×TAE） 80伏恒壓電泳 全部PCR產物上樣電泳： 6uL 10xloading 6uL SYBR marker部分： 10uL marker（含loading buffer） 1uL SYBR |
因為PCR產物會有一些副產物，所以要用電泳的方法分離各種PCR產物。這樣也能分離TaqE 等雜質。 為了分辨PCR產物和PCR副產品，需要跑一個分子量marker，我們的產物是1.6kp。 用TAE的原因是高嚴可以降低Agarose熔點，促進之后的DNA 吸附。 |
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3 PCR產物的回收（玻璃奶吸附法） |
1) | 紫外燈下切膠，稱膠重 |
SYBR會使DNA部分顯出綠色熒光，在紫外燈下辨認綠色熒光，可將膠切下。 |
| 2) | 每100mg膠加入300 uL溶膠液，50 oC溶膠 | 讓DNA充分釋放到液體中。 | |
| 3) | 將在-20 oC凍存的玻璃奶解凍，振勻！！ | 玻璃奶為細微的玻璃小顆粒，因酷似奶狀而得名。它為懸濁液，而可以起吸附作用的小顆粒會沉降下來，所以，只有搖勻，我們才能渠道足量的玻璃小顆粒，完成分離的過程。 | |
| 4) | 在溶解后的膠液中加入10 uL玻璃奶，吹打均勻，冰浴沉淀10min， 10,000rpm離心1min，去上清。 |
這是一個類似于吸附層析的過程。DNA會特異的吸附于玻璃奶的小顆粒上，而膠不會吸附于其上，故可以起到分離的效果。 高鹽能促進吸附。 |
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| 5) | 在離心所得沉淀中加入200 uL稀釋濃縮洗膠液（3體積濃縮洗膠液加入7體積無水乙醇即得稀釋液），吹打均勻，10,000rpm離心1min，去上清，如此洗兩次。 | 這是一個洗滌的過程。 | |
| 6) | 50 0C干燥。 | ||
| 7) | 加入20 uL TE，吹打均勻，60 oC 5-10min 溶解DNA，12,000rpm 2min，收集上清為回收的PCR產物，-20oC保存。 |
此步驟是解析。 讓DNA釋放到溶液中，李新的方法可以將DNA純化。 低鹽有利于解吸附。 |
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檢測是否含有DNA 取2uLDNA混合0.5uLSYBR，直接到紫外燈下觀察，若有綠色熒光，則證明有DNA存在。 |
實驗結果及分析
本次試驗中，在最后一步檢測中看到了熒光，說明了DNA的存在，證明回收到了PCR的產物