一、實驗原理
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain
Reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統，其原理類似DNA分子的天然復制過程，是將在待擴增的DNA片段和與其兩側互補的兩個寡聚核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環后，DNA擴增
2n 倍。該技術已成為分子生物學中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序實際上是一個在模板DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應。擴增的特異性取決于引物與模板DNA的結合。整個擴增過程分三步：①變性，加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板DNA引物按堿基配對原則互補結合，也存在兩條模板鏈之間的結合，但由于引物的高濃度、結構簡單等特點，主要的結合發生在引物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的
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′端開始，結合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新的DNA鏈。完成以上三步為一個循環，每經過一個循環，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA鏈又成為下一輪循環的模板。經過25～40個循環后，DNA
可擴增106～109倍。 現用圖示說明PCR原理:
二、儀器及試劑
1.儀器：PCR儀、臺式離心機、移液器及吸頭、PCR薄壁管、電泳儀等
2.試劑：
10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq酶提供）：
250～500 mmol/L KCl
100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4）
15～20 mmol/L MgCl2
0.5% Tween-20
1mg/L BSA
其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖凝膠、等
三、操作步驟
1. PCR 體系（40ul）：
4ul 10XPCR 緩沖液
4ul 25mM MgCl2（根據不同公司PCR 緩沖液的不同而定）
Xul 模板DNA ≥50ng
1ul 上游引物（50-100ng）
1ul 下游引物（50-100ng）
1ul dNTP Mixture（終濃度20－200uM）
0.4 ul Taq聚合酶
加ddH2O至40ul
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2. 將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6000 rpm離心15 sec使反應成分集于管底。
3. PCR反應熱循環程序設置：
（1） 95℃ 300s 變性
（2） 94℃ 45s 變性
（3） 55℃ 45s 退火（根據不同引物可能有不同退火溫度）
（4） 72℃ 45s 延伸（每分鐘可延伸1kp）
重復步驟2-4共 30 循環
（5） 72℃ 600s 延伸
反應結束后短暫離心，吸取少量（10ul）進行分析，其余置
4℃保存備用。
4. 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。
四、 注意事項：
1. PCR 體系所加成分的實際用量應根據實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。
2.加樣時要認真,吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。
3.Taq聚合酶（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。
五 、影響PCR的主要因素
1.模板DNA
單鏈、雙鏈DNA均可作為PCR的模板，DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，一般為100ul反應液有105-106個目標分子。PCR反應時模板變性要充分。
2. PCR引物
PCR引物設計是否成功是能否獲得高質量PCR產物最關鍵的因素之一。在設計和應用時，需注意以下重要環節：
（1）PCR引物的長度約為18～30個核苷酸，并且成對引物間的G＋C含量應相似。以使它們在相近的溫度下與其互補序列結合。G+C含量應為45%～55%之間。堿基分布是隨機的，應避免連續出現4個以上的單一堿基，尤其是不應在其3，端出現3個連續G或C，否則會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。引物3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避免選用T
,尤其應避免連續出現2個以上T。
（2）一般來說，PCR產物≤500bp時，引物長度選擇16-18bp；PCR產物≥5kb時，引物長度選擇24bp左右為宜。
（3）要避免引物分子自身序列互補，否則會形成發夾樣二級結構。兩個PCR引物相互之間的3，末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。