PCR基因擴增2

（4）引物的熔點溫度（Tm值）要適當。Tm值與引物的堿基組成和長度有關；PCR引物的GC/AT應與要擴增的模板DNA相當或略高些。一般熔點溫度以大于55℃為宜。

（5）引物的3，末端必須與模板嚴格互補，而5，末端的要求可靈活些。

（6）目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件，從EMBL或Genebank中查找有關基因序列，并對設計的引物在引物二聚體形成、自身互補性及特異性等方面進行分析評價。

（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內切酶位點。為了保證內切酶有效酶切擴增產物，一般在酶切位點的5，端再加上幾個額外的堿基。

（8）引物的濃度，在終濃度為0.2～1.0 umol/L的范圍內產量基本相同，低于0.2 umol/L時會影響產量。但過高時一乃不經濟，二則會出現非特異擴增及增加引物二聚體的產生。

3. 熱穩定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量為2.5 U/100uL 反應體積。酶量過多易導致非特異性產物的產生。該類酶的最適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當高的活性，易引起不完全配對的引物-模板的非特異延伸及引物二聚體的擴增延伸，所以應注意防止非特異性產物的出現。

4. dNTPs

PCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種dNTPs應等當量。濃度

低則反應速度下降，過高則特異性下降，可根據具體實驗來確定最適的dNTP濃度。

5. PCR緩沖液

因PCR反應中的dNTP能與Mg2+結合，影響反應液中游離Mg2+的濃度，所以應按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標準的PCR反應中（dNTP濃度200umol/L），Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響PCR的產量及產物特異性。濃度高則出現非特異擴增，過低則酶活性顯著下降。應用無核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護作用。

6. PCR循環的溫度

預變性：起始變性的時間應該長些，以使變性充分。一般為94℃ 3-5min。變性不完全時，DNA雙鏈會很快復性，影響PCR反應，但若變性溫度太高（不宜超過95℃），會影響Taq酶的活性。

變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：應根據具體反應中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為50-72℃。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物3，端不正確核苷酸的錯誤延伸。

延伸：一般為72℃ 60-90s。最后一個循環后應在72℃保留5min，以保證PCR產物合成的完整性。

7．平臺效應和PCR循環的次數

在PCR基因擴增的后期，由于產物的堆積，將使原來產物以指數增加的速度變為平坦曲線，即所謂平臺效應。它的出現是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩定性的降低、終產物的阻滯效應及非特異性產物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環次數，既能得到足夠量的PCR產物，又不要無意義地增加循環次數。

8. 操作環境

避免環境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標DNA的污染等。