PCR基因芯片上熒光PCR反應的研究（一）

郝麟1）  朱平1）＊  于曉梅2）  張大成2）  趙新生3）   歐陽賤華3

（1）北京大學第一醫院 北京 100034； 2）北京大學微電子學研究所 北京100871； 3）北京大學化學與分子工程學院    北京100871）

目的:
我們設計一種含有大量微反應池的PCR基因芯片，能對基因的重排，突變和缺失等基因變異進行檢測。PCR基因芯片的關鍵問題是如何檢測出來在微反應池內獲得的極其微量PCR產物。本文應用一些臨床病例的實例標本，觀察能否在基因芯片上進行不同的熒光摻入PCR反應并根據基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。

方法：制作以硅片為材料的PCR基因芯片。利用健康外周血，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細胞貧（XLSA）家系成員6人外周血DNA做PCR-SSCP，并測序確定。設計檢測此點突變的Taqman探針進行熒光PCR反應，在芯片上進行同樣的反應，與上述反應結果進行對照。利用4步位點特異PCR結合SYBR熒光染料初篩HLAA2，并在芯片上進行同樣的反應，與上述反應結果進行對照。

結果：設計并制作了有192個微反應池以硅片為材料的PCR基因芯片。PCR-SSCP分析與測序確定X連鎖遺傳性鐵幼粒細胞貧血家系兩患者的ALAS2基因第5外顯子有G514A點突變，母親、外祖母為雜合子攜帶者。設計Taqman探針對此家系中六位成員DNA與二份正常男性臍血DNA檢測與預期結果相符。將上述結果中同樣的樣本移入芯片進行PCR反應，結果與常規熒光PCR反應的結果一致。SYBR熒光染料PCR反應與芯片上SYBR熒光染料PCR反應的結果與預期完全相符。

結論：利用TaqMan探針與SYBR
Green熒光染料可以在PCR基因芯片上順利進行PCR反應，根據基因芯片上熒光的變化檢測出點突變與單核苷酸多態性。為基因芯片的臨床應用打下了基礎。

關鍵詞： PCR基因芯片；熒光PCR反應；Taqman探針；熒光染料；

基因芯片技術具有快速多樣、微型化和自動化[1～4]等特點在生物醫學領域廣泛的應用。但由于其基本原理是基于核酸雜交技術，有著內在的缺陷[5-6]，實驗的敏感性和重復性都存在一定問題。核酸雜交較適合于檢測基因的表達，不易檢測基因組DNA的基因的重排，突變和缺失。而大多數腫瘤性疾病和一些遺傳變異和表型的改變與后者有關。為了解決上述問題，我們將芯片技術與熒光PCR技術相結合，設立設計一種含有大量微反應池的PCR基因芯片，以期能快速、準確的對基因的重排，突變和缺失等基因變異進行檢測。常規PCR反應產物的檢測是電泳后觀察獲得基因片段的大小，PCR基因芯片的關鍵問題是如何檢測出來在微反應池內獲得的極其微量PCR產物。本文應用一些臨床病例的實例標本，觀察能否在基因芯片上進行不同的熒光PCR反應，如何根據基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。

1 病例、材料與方法
 
1.1  基因組DNA標本
健康成年人外周血DNA，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細胞貧血（XLSA）家系成員6人外周血DNA均獲自北京大學第一醫院，均簽署知情同意書。XLSA家系中患者為兄弟兩個，年齡分別為8、7歲，都在嬰兒時即發現貧血。家中有一個健康的姐姐，在兩兄弟出生前，母親曾有多次男胎自然流產史。成熟紅細胞形態呈典型的小細胞低色素性貧血，骨髓鐵染色可見大量環形鐵粒幼細胞。臨床初步診斷遺傳性鐵粒幼細胞貧血。

1.2  PCR基因芯片的設計與制作［7］
PCR基因芯片上制備大量微反應室，可以同時進行不同的PCR反應。采用單拋525mm厚硅片作為襯底材料。硅片常規清洗后，在10-50°C下生長800nm厚的濕氧熱氧化層，作為第一層掩膜層。然后150nm厚的Si3N4低壓化學氣相淀積（LPCVD）在硅片表面，形成第二層掩膜。第一次光刻，RIE刻蝕反應室及其流道上的Si3N4；采用掩膜板2光刻反應室的圖形，RIE和BHF刻蝕反應室表面的SiO2。KOH腐蝕反應室的硅至150 um，此時流道上的硅由于有足夠厚的SiO2作為保護層，沒有開始腐蝕。腐蝕掉流道上的SiO2，同時進行反應室及流道上繼續SiO2的腐蝕，KOH腐蝕的速度為1um／min，芯片進行熱氧化生長300 um SiO2，以增強其表面的親水性，保證反應液可以在芯片內順利流動。芯片通過PVC聚合物壓合封閉。

1.3  PCR基因芯片上應用Taqman熒光探針
1.3.1 PCR擴增XLSA家系ALAS2基因第五外顯子并且獲得基因片段
經www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST查詢ALAS2基因的全長序列。應用Primer3.0軟件設計第五外顯子引物：上游引物: 5’-ccataagtcaatgactgagc-3’，下游引物: 5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃ 3分鐘，然后94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 1分鐘共30個循環，72℃ 延伸5分鐘條件下進行PCR反應。取0.5EP管，加入7ulPCR產物及3ulSSCP上樣緩沖液，96℃變性10分鐘。10％SSCP－聚丙酰胺凝膠及銀染色。PCR 產物交上海博亞公司直接測序。