基因芯片技術具有快速多樣、微型化和自動化等特點在生物醫學領域廣泛的應用。但由于其基本原理是基于核酸雜交技術，有著內在的缺陷，實驗的敏感性和重復性都存在一定問題。核酸雜交較適合于檢測基因的表達，不易檢測基因組DNA的基因的重排，突變和缺失。
而大多數腫瘤性疾病和一些遺傳變異和表型的改變與后者有關。為了解決上述問題，我們將芯片技術與熒光PCR技術相結合，設立設計一種含有大量微反應池的PCR基因芯片，以期能快速、準確的對基因的重排，突變和缺失等基因變異進行檢測。
常規PCR反應產物的檢測是電泳后觀察獲得基因片段的大小，PCR基因芯片的關鍵問題是如何檢測出來在微反應池內獲得的極其微量PCR產物。本文應用一些臨床病例的實例標本，觀察能否在基因芯片上進行不同的熒光PCR反應，如何根據基因芯片上熒光的變化判斷基因的變異。
1、病例、材料與方法
1.1 基因組DNA標本
健康成年人外周血DNA，正常臍血DNA，X連鎖遺傳性鐵粒幼細胞貧血（XLSA）家系成員6人外周血DNA均獲自北京大學第一醫院，均簽署知情同意書。XLSA家系中患者為兄弟兩個，年齡分別為8、7歲，都在嬰兒時即發現貧血。家中有一個健康的姐姐，在兩兄弟出生前，母親曾有多次男胎自然流產史。成熟紅細胞形態呈典型的小細胞低色素性貧血，骨髓鐵染色可見大量環形鐵粒幼細胞。臨床初步診斷遺傳性鐵粒幼細胞貧血。
1.2 PCR基因芯片的設計與制作
PCR基因芯片上制備大量微反應室，可以同時進行不同的PCR反應。采用單拋525mm厚硅片作為襯底材料。硅片常規清洗后，在10～50℃下生長800nm厚的濕氧熱氧化層，作為第一層掩膜層。然后150nm厚的Si3N4低壓化學氣相淀積（LPCVD）在硅片表面，形成第二層掩膜。
第一次光刻，RIE刻蝕反應室及其流道上的Si3N4；采用掩膜板2光刻反應室的圖形，RIE和BHF刻蝕反應室表面的SiO2。KOH腐蝕反應室的硅至150um，此時流道上的硅由于有足夠厚的SiO2作為保護層，沒有開始腐蝕。腐蝕掉流道上的SiO2，同時進行反應室及流道上繼續SiO2的腐蝕，KOH腐蝕的速度為1um/min，芯片進行熱氧化生長300umSiO2，以增強其表面的親水性，保證反應液可以在芯片內順利流動。芯片通過PVC聚合物壓合封閉。
1.3 PCR基因芯片上應用Taqman熒光探針
1.3.1 PCR擴增XLSA家系ALAS2基因第五外顯子并且獲得基因片段
經查詢ALAS2基因的全長序列。應用Primer3.0軟件設計第五外顯子引物——上游引物：5’-ccataagtcaatgactgagc-3’，下游引物：5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃3分鐘，然后94℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘共30個循環，72℃延伸5分鐘條件下進行PCR反應。取0.5EP管，加入7ulPCR產物及3ulSSCP上樣緩沖液，96℃變性10分鐘。10%SSCP-聚丙酰胺凝膠及銀染色。PCR產物交上海博亞公司直接測序。
1.3.2 PCR-SSCP方法分析按照我室常規進行。
1.3.3 Taqman熒光探針 以發現的ALAS2基因第五外顯子點突變為中心設計，序列如下：5’（熒光集團）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC-TAMRA（淬滅集團）3’，設計Taqman熒光PCR反應的上下游引物。序列如下：上游引物：5’-tcagttatgaccagtttttcaggg-3’，下游引物：5’-gaacacacggtaggtgtgatcct-3’。
1.3.4 常規實時定量PCR檢測ALAS2基因第五外顯子基因突變在GeneAmp? SDS 5700熒光PCR儀上進行，反應條件50℃2分鐘，94℃10分鐘，然后94℃30秒，60℃30秒共40個循環。
1.3.5 PCR基因芯片上進行PCR反應 用0.5ml清潔醫用注射器緩慢吸取Taqman熒光PCR反應液。刺破芯片表面PVC封膜，沿加樣孔緩慢將反應液加入，用透明膠帶封住加樣孔。將芯片放入Gene Amp PCR System 2400 PCR儀，行PCR反應，探索不同反應條件。