(1)擴增效率低: 優化反應條件；設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應等。
(2)模版降解或模版濃度太高。
(3)試劑靈敏度不好：更換更高靈敏度、抗干擾的試劑。
(4)檢測基因結構復雜：高GC、復雜二級結構和長片段模版，都會影響PCR擴增。
(5)擴增產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。
