PCR實驗常見問題、原因分析及其解決方案

PCR產物的電泳檢測時間，一般為48h以內，有些最好于當日進行檢查，大于48h后帶型不規則甚至消失。
但有時仍會與到這樣那樣的問題，影響檢測結果的判斷，具體歸類為以下常見的4點，描述如下：

問題一：無擴增產物
現象：正對照有條帶，而樣品則無。

原因：
1、模板:含有抑制物，含量低。
2、Buffer對樣品不合適。
3、引物設計不當或者發生降解。
4、反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短。

對策：
1、純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更換Buffer或調整濃度。
3、重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物。
4、降低退火溫度、延長延伸時間。

問題二：非特異性擴增
現象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶。

原因：
1、引物特異性差。
2、模板或引物濃度過高。
3、酶量過多。
4、Mg2+濃度偏高。
5、退火溫度偏低。
6、循環次數過多。

對策：
1、重新設計引物或者使用巢式PCR。
2、適當降低模板或引物濃度。
3、適當減少酶量。
4、降低鎂離子濃度。
5、適當提高退火溫度或使用二階段溫度法。
6、減少循環次數。

問題三：拖尾
現象：產物在凝膠上呈Smear狀態。

原因：
1、模板不純。
2、Buffer不合適。
3、退火溫度偏低。
4、酶量過多。
5、dNTP、Mg 2+濃度偏高。
6、循環次數過多。

對策：
1、純化模板。
2、更換Buffer。
3、適當提高退火溫度。
4、適量用酶。
5、適當降低dNTP和鎂離子的濃度。
6、減少循環次數。

問題四：假陽性
現象：空白對照出現目的擴增產物。

原因：
靶序列或擴增產物的交叉污染。

對策：   
1、操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。
2、除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。
3、各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。