④引物的額外序列與退火溫度
若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限制酶切位點或者GC發夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5'端添加無關序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個擴增循環；然后在假定引物5'端序列已經加入到模板中，計算得出的退火溫度下進行其余的循環。
在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5'端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR反應時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數、從“最近鄰位”的計算方式得到，現有的PCR引物設計軟件大多數都采用這種方式。
⑤引物的3'末端核苷酸組成
引物3'末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3'末端最后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3'末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。
引物3'末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3'末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現，這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態，從而影響擴增成功。
引物3'末端的穩定性由引物3'末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3'末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發。
需要注意的是，引物3'末端應盡量避免T。實驗證明，以T結尾的引物即使與T, G或C錯配仍可有效延伸。
⑥PCR產物的長度及在耙序列內的位置
所有的計算機程序都提供對PCR產物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產物長度部分取決于模板材料。
預期產物的特定長度經常取決于應用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗方法，120～300bp的小DNA擴增產物可能是最好的。產物應具有好的特異性和高的產生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產物可以通過采用兩步擴增循環方法得到，從而減少擴增時間。
其他PCR方法有不同的最佳產物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達時，產物應該足夠大以便構成競爭性模板，這樣，產物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產物一般在250～750bp范圍內。
⑦補充說明
若在cDNA序列內找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產物保持在mRNA的編碼區域內，因為這是生成蛋白質的獨特序列，不像3'末端非編碼區域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區別。
若PCR的目的是克隆一個基因或cDNA的特異序列，產物的大小是根據具體應用預選的。在這里，計算機程序可以提供關于期望區域側翼選擇引物對的信息。
在選擇用來擴增來自不同物種DNA的引物時，應避開mRNA的5'和3'末端非翻譯區序列，因為它們可能沒有任何的同源性。
3．簡并引物設計
①設計簡并引物時，一定要檢查靶擴增區域選定氨基酸遺傳密碼的簡并度。很顯然，我們期望選擇簡并度最低的氨基酸，達到提高特異性的目的。
②充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。
③應努力避免3'末端的簡并，對于大多數氨基酸殘基來說，意味著引物3'末端不要位于密碼子的第三位。
④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。
4． 測序引物設計
當然，測序引物的設計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設計的話；那么除了按照上面所提到的引物設計通用標準外，還需要注意兩點：
①測序引物的特異性的標準掌握應該更嚴格一些，也就是說設計時更優先考慮特異性。因為在測序反應中，如果引物與模板在非預期位置退火并引發鏈延伸，會對結果對來很大的干擾甚至造成結果無法識讀。
②測序引物的Tm值適當高一些。現在大部分測序反應均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應順利跨過待測模板的二級結構區，也有助于降低非特異反應。
5． 探針的設計
探針的設計，根據不同的用途各有其設計特點，這里只是就通用的原則進行討論：
①探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時一種堿基連續重復不超過4個，以免非特異性雜交產生。
③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發夾”結構存在，這一點上的要求就要比普通引物設計嚴格得多。
④如果探針地靶目標是多個基因的混合物，就必須控制該探針與無關基因之間的相似性在70%以下。
PCR中常見問題分析與對策．
PCR產物的電泳檢測時間
一般認為PCR產物應在48h以內完成電泳檢測，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現不規則，甚至消失。