2）未選擇跟儀器加熱模塊規格匹配的耗材
目前Applied BiosystemsTM系列熒光定量PCR 儀加熱模塊分0.2ml跟0.1ml兩種，實驗前一定要確定自己的儀器是哪一種加熱模塊，再來選擇對應的耗材。如果0.1ml加熱模塊用成0.2ml耗材，則會造成耗材壓扁，甚至造成機器故障；如果0.2ml加熱模塊用成0.1ml耗材，則會造成反應管的外壁和熒光定量PCR儀器的溫控模塊沒有充分接觸，從而出現熱傳導不充分，進而影響酶的活性，會引起重復性不好（圖四），或者溶解曲線多峰（非特異擴增），甚至是假陰性結果；
圖四：耗材規格跟加熱模塊不匹配造成重復孔間差異
3）使用了質量比較差的耗材
Applied BiosystemsTM系列的熒光定量PCR儀器是一個開放的平臺，客戶可以使用開放的試劑、開放的耗材。但是目前市面上熒光定量PCR耗材種類繁多，質量也是良莠不齊，在耗材選擇上盡量選擇質量、品牌好一點的，切莫因為便宜選用質量很差或不符合要求的耗材，否則會引起一系列問題，引來實驗的困擾，造成不必要的時間、精力和試劑、樣本的浪費。比如質量不好的耗材可能會引起熒光值不穩定，這會造成反應孔的自動基線扣除錯誤，得到不準確的CT值（圖五左圖），更換質量好的耗材后，熒光信號正常（圖五右圖）；
圖五：質量不好的耗材引起熒光值不穩定圖及更換Applied BiosystemsTM耗材后結果
如果使用的PCR反應板封膜質量不好，在PCR過程中受到水蒸氣的影響，容易產生變形（圖六），這樣會引起“optical warping”，即“光學扭曲”現象（圖七 左圖），該實驗中由于使用了ROX作為參比染料，ROX有效的校正了這種熒光信號的變化，均一化的擴增圖結果是正常的（圖七 右圖）。
圖六：PCR過程中水蒸氣使得封膜變形
圖七：光學扭曲結果圖及ROX均一化結果圖
除了耗材外，跟儀器配套使用的配件也要檢查是否使用正確，比如QuantStudio 5配套的8聯管托架，在使用的時候只用托架的下半部分，如果忘記把上半部分取下，有可能會影響擴增（圖八）。
圖八：未將托架上半部分取下，造成有些靶標未擴增
3 確定所用試劑是否正常
如果設置都正確，耗材及配件也都沒問題，但是擴增曲線還是異常，這時候要確定下所用試劑是否正常。首先要確定試劑是否有效，包括查看試劑是否在有效期內，是否反復凍融多次，運輸條件是否正常。可以通過比較試劑的批次號，結合實驗中的陽性對照結果，確定試劑的有效性。
其次要觀察擴增完的試劑體積，如果在擴增過程中有試劑的蒸發，可能會引起擴增曲線抬升現象，如果實驗體系中加入了ROX作為參比熒光，ROX熒光可以區分擴增曲線抬升是真擴增，還是蒸發。比如反應體系存在蒸發，水分丟失，ROX濃度會增加，ROX參比熒光上抬（圖九左圖），而正常孔中ROX熒光會一直不變（圖九右圖），所以在加完試劑上機前，一定要檢查耗材是否已經密封，防止試劑蒸發，試劑蒸發嚴重的還可能導至整個實驗室的氣溶膠污染。
圖九：試劑蒸發引起擴增曲線抬升
4 確定實驗過程中的操作細節
如果以上都正常，還要確定下實驗過程中的操作細節。比如在做標準曲線的時候是否是梯度稀釋的標準品，如果不是梯度稀釋標準品，可能會引起標準曲線擴增效率或者R2值異常；從冰箱冷凍中取出的試劑是否有混勻，如果試劑融化后沒有混勻，這時候取出的試劑不是均一的，會影響后面的擴增；定量PCR預混液跟核酸模板加好后是否混勻，如果沒有混勻，特別是樣本體積比較大的時候（超過PCR體系的20%），更容易發生optical
mixing現象。因為樣本是水相會在上層，試劑（含有甘油成分）會在下層，在前期的PCR過程中不足以混勻完全，這樣會形成折射，熒光較強，而一般加熱幾個循環后樣本跟預混液會混勻，熒光就變穩定了（圖十）。
圖十：樣本跟預混液未混勻現象
還有上機的反應體系里盡量不要有大的氣泡，有氣泡的話，中間容易形成折射，干擾熒光的采集（圖十一）。所以實時熒光定量PCR實驗的細節還是要特別注意的。
圖十一：反應體系中有氣泡
以上是我們在面對常見的一些異常擴增曲線的分析思路，希望能夠幫助各位老師處理擴增曲線異常的問題。除了我們提到的幾種情況之外，在平時實驗過程中我們可能還會遇到“千姿百態”的異常擴增曲線，大家可以利用上面介紹的思路加以分析。