PCR引物設計及評價實驗

目的基因序列

電腦

一、引物搜索

1.  打開Primer premier5.0軟件，調入人瘦素（leptin）基因序列：點擊“file”    “open”   “ DNA sequence”；或者直接點擊 “file”  “new”  “DNA sequence”，彈出一對話框如下圖，然后將序列人瘦素(leptin) 基因復制在空白框。





2.  序列文件顯示如圖，點擊“Primer”；



3.  進一步點擊“search” 按鈕，出現“search criteria”窗口，有多種參數可以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。我們將Product Size設置300－350，其他參數使用默認值。



然后點擊“OK” ，隨之出現的Search Progress窗口中顯示Search  Completed時，再點擊“OK”。



4、這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標。



5.  按照搜尋結果顯示，在主窗口中檢查該引物對的二級結構情況，逐條分析，依次篩選。下面進行序列篩選：點擊其中一對引物，如第21#引物，在“Peimer Premier”主窗口，如圖所示：該圖分三部分，最上面是圖示PCR模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當所分析的引物有這四種結構的形成可能時，按鈕由“None” 變成“Found” ，點擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有“Found”，只有“None” 。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。



二、引物分析

1.  打開oligo的頁面如下：


2.  單擊file菜單再點open或點擊“打開”快捷圖標或者用快捷鍵“CTrl＋O”可彈出一對話框，然后選擇序列人瘦素(leptin) 基因。出現以下窗口。



3.  點擊“window”再點擊“Tile”，出現以下窗口，圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG和Frq，因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標。

?G值反映了序列與模板的結合強度，最好引物的?G值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低。

Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發聚合反應。

Frq曲線為“Oligo 6”新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用3’端Frq值相對較低的片段。



4.  在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成紅色，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。



5.  當上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價。可以用“Analyse”菜單分析你的引物：比如有無引物二聚體、發卡結構等等。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5為好。當然，在設計克隆目的的PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構，而且能值不會太低。這種PCR需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。

當我們結束以上三項檢測，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結性地顯示該引物的位置、產物大小、Tm值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。

1.  注意：在填antisense時要注意3’到5’翻轉成5’到3’

一、引物設計原則

聚合梅鏈式反應（polymerase chain reaction）即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱基因的體外擴增法。PCR技術已成為分子生物學研究中使用最多，最廣泛的手段之一，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環，使用不合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行，可以直接提交模板序列到特定網頁，得到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。

引物設計原則如下

1.  引物應在序列的保守區域設計并具有特異性。引物序列應位于基因組DNA的高度保守區，且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結合，提高反應的特異性；

2.  引物的長度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應；

3.  引物不應形成二級結構。引物二聚體及發夾結構的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行；

4.  引物序列的GC含量一般為40-60%。過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大；

5.  引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；

6.  引物5'端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。可根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。

7.  引物3’端不可修飾。引物3'端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3'端使用堿基A。

8.  引物序列自身或者引物之間不能在出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加；

9.  G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3'端G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間G值相對較高的引物。引物的3’端的G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應；

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低，在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

二、引物設計軟件Primer premier5.0及oligo6.0

“Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設計、限制性內切酶位點分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”還具有同源性分析功能，但并非其特長，在此略過。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設計簡并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA 與蛋白序列的互換、語音提示鍵盤輸入等等。有時需要根據一段氨基酸序列反推到DNA 來設計引物，由于大多數氨基酸（20 種常見結構氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時，會遇到部分堿基的不確定性。這樣設計并合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡并引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。“Premier”可以針對模板DNA 的來源以相應的遺傳密碼規則轉換DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標準（Standard）、脊椎動物線粒體（Vertebrate Mito-chondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。
 
對引物進行分析評價的的軟件中，“oligo” 是最著名的。它的使用并不十分復雜，Oligo 6.0的界面是三個圖，Tm圖、ΔG圖和Frq圖。“Oligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至于能風靡全世界。所以引物設計的最佳搭配是“Premier”進行引物搜索“Oligo” 對引物分析評價。