PCR引物設計及軟件使用技巧
張新宇，朱有康，高燕寧
（中國協和醫科大學中國醫學科學院腫瘤研究所，北京100021）
摘要：本文旨在介紹使用軟件設計PCR引物的技巧。在PCR引物設計原則的基礎上，詳
細介紹了兩種常用引物設計軟件的基本使用方法，并對其各自的優缺點進行了比較。一般性
引物自動搜索可采用“PremierPrimer5”軟件，而引物的評價分析則可采用“Oligo6”軟件。
關鍵詞：PCR；引物設計
中圖分類號：Q524文獻標識碼：文章編號：
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自從1985年KarnyMullis發明了聚合酶鏈式反應以來，PCR技術已成為分子生物學研
究中使用最多、最廣泛的手段之一[1]，而引物設計是PCR技術中至關重要的一環。使用不
合適的PCR引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚
體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
現在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網頁，得
到設計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設計專業軟件。一般來說，專門進行PCR
引物設計的專業軟件功能更為強大，但使用起來卻不太容易。本文將就引物設計原則及軟件
使用問題進行探討。
引物設計的原則
引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避
免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即
錯配)。
具體實現這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primerlength），產物長度
（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性
(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發夾結構（duplex
formationandhairpin）的能值，在錯配位點（falseprimingsite）的引發效率，引物及產物的
GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，
引進突變等。根據有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點：
1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導致其延
伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應[2]。
2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導
致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增
加[2]。
3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配
位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應
當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反
應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。
4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC
含量不能相差太大[2][5]。
5.引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種
方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(thenearest
neighbormethod)[6][7]。
6.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定
性。應當選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G值相對較高的引
物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應[6]。
7.引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且
降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行[8]。
8.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載
體的相應序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC
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含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產
物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條
件。
引物的自動搜索和評價分析
軟件的引物設計功能主要體現在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數
商業版軟件能夠做到，其中以“Oligo6”最優秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在
這方面的側重點不同，因此自動搜索的結果也不盡相同。據筆者的經驗，自動搜索功能以
“PremierPrimer”為最強且方便使用，“Oligo6”其次，其他軟件如“VectorNTISuit”、
“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動搜索功能，但搜索結果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自動搜索的基礎上還要輔以人工分析。筆者認為引物設計軟件
的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進行自動搜索，“Oligo”
進行分析評價，如此可快速設計出成功率很高的引物。
PrimerPremier5.0的使用技巧簡介
1.功能
“Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設計()、
限制性內切酶位點分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”還具有同源
性分析功能（），但并非其特長，在此略過。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中
最重要的是設計簡并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA與蛋白序列的互換（）、
語音提示鍵盤輸入（）等等。
有時需要根據一段氨基酸序列反推到DNA來設計引物，由于大多數氨基酸（20種常見
結構氨基酸中的18種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時，會
遇到部分堿基的不確定性。這樣設計并合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列
組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡并引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞
結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。“Premier”可以針對模
板DNA的來源以相應的遺傳密碼規則轉換DNA和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結
構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）、無脊椎動物線粒
體（InvertebrateMitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（PlantMitochondrion）、
原生動物線粒體（ProtozoanMitochondrion）、一般標準（Standard）、脊椎動物線粒體（Vertebrate
Mitochondrion）和酵母線粒體（YeastMitochondrion）。
2.使用步驟及技巧
“Premier”軟件啟動界面如下：
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其主要功能在主界面上一目了然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點分析及基元查找功
能比較簡單，點擊該功能按鈕后，選擇相應的限制性內切酶或基元（如-10序列，-35序列
等），按確定即可。常見的限制性內切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新
限制性內切酶或基元。
進行引物設計時，點擊按鈕，界面如下：
進一步點擊按鈕，出現“searchcriteria”窗口，有多種參數可以調整。搜索目
的（SeachFor）有三種選項，PCR引物（PCRPrimers），測序引物（SequencingPrimers），
雜交探針（HybridizationProbes）。搜索類型(SearchType)可選擇分別或同時查找上、下游引
物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游
引物為主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外還可改變選擇區域（Search
Ranges），引物長度（PrimerLength），選擇方式（SearchMode），參數選擇（SearchParameters）
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等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。如果沒有特殊要求，建議使用默認設置。然
后按，隨之出現的SearchProgress窗口中顯示SearchCompleted時，再按，
這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物
(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優劣次序（Rating）排列，滿分
為100，即各指標基本都能達標（如下圖）。
點擊其中一對引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示“PeimerPremier”
主窗口，如圖所示：
該圖分三部分，最上面是圖示PCR模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些
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性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引
發情況（FalsePriming），及上下游引物之間二聚體形成情況（CrossDimer）。當所分析的引
物有這四種結構的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的
窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最
好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾
給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。
在需要對引物進行修飾編輯時，如在5’端加入酶切位點，可點擊，然后修改
引物序列。若要回到搜索結果中，則點擊按鈕。
如果要設計簡并引物，只需根據源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規
則，反推至DNA序列即可。對簡并引物的分析不需像一般引物那樣嚴格。
總之，“Premier”有優秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標的分析，而且容易
使用，是一個相當不錯的軟件。
Oligo6.22使用技巧簡介
1.功能
在專門的引物設計軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復雜，但初學者容
易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo5.0的初始界面是兩個圖：Tm圖和ΔG圖；Oligo6.22的界
面更復雜，出現三個圖，加了個Frq圖。“Oligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物
設計。但它的引物分析功能如此強大以至于能風靡全世界。
2.使用（以Oligo6.22為例）
Oligo6.22的啟動界面如下：
圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，為鄰近6
至7個堿基組成的亞單位在一個指定數據庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發
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的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows
菜單改為tili方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同于Oligo
5.0，只是顯示更清楚了。
經過Windows/Tili項后的顯示如圖：
在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm圖塊上左
下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選
取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。?G值反映了序列與模板的結
合強度，最好引物的?G值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對低（如圖：）
Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發聚合反應。Frq曲線
為“Oligo6”新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選
用3’端Frq值相對較低的片段。
當上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價并根據評價對引物進行修改。首先檢查
引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（crossdimer）。二聚體形成的能值
越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，
因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；
與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5為好。
當然，在設計克隆目的的PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構，
而且能值不會太低。這種PCR需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾
結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的
GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游
引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果PCR的模板不是基
因組DNA，而是一個特定模板序列，那么最好還進行Falseprimingsite的檢測。這項檢查
可以看出引物在非目的位點引發PCR反應的可能性。如果引物在錯配位點的引發效率比較
高，就可能出假陽性的PCR結果。一般在錯配引發效率以不超過100為好，但對于特定的
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模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的
引發效率為450以上，而在錯誤位點的引發效率為130，那么這對引物也是可以接受的。
當我們結束以上四項檢測，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結性地顯示該引物的位
置、產物大小、Tm值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。
由于“Oligo”軟件的引物自動搜索功能與“PrimerPremier5”的相類似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟件自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求
去尋找最佳引物，如果參數設置得當將大大提高工作效率。
除了本地引物設計軟件之外，現在還有一些網上引物設計軟件，如由WhiteheadInstitute
開發的“Primer3”等（本網站
http://210.72.11.60已引進并調試好該軟件，歡迎使用）。該
軟件的獨特之處在于，對全基因組PCR的引物設計；可以將設計好的引物對后臺核酸數據
庫進行比對，發現并排除可引發錯配的引物。因此建議經常做全基因組PCR的用戶試用。
參考文獻（References）：
[1]H.A.艾得希主編,田丁等譯.PCR技術——DNA擴增的原理與應用.北京:北京醫科大學中國協
和醫科大學聯合出版社,1991.
[2]林萬明著.PCR技術操作與應用指南.北京:人民軍醫出版社,1993.
[3]朱平主編.PCR基因擴增實驗操作手冊.北京:中國科學技術出版社,1992
[4]鄭仲承.寡核苷酸的優化設計，生命的化學,2001,21(3):254-256.
[5]GeorgeH.KellerMarkM.Manak.DNAprobes.1992.
[6]Oligo軟件幫助文件(Oligo.HLP).
[7]Martin,F.H.,Castro,M.M.,andTinoco,Jr.I.Basepairinginvolvingdeoxyinisine,implicationsfor
probedesign.NucleicAcidsRes,1985,13:8927-8938.
[8]Rychlik,W.andRhoads,R.E.Acomputerprogramforchoosingoptimaloligonucleotidesforfilter
hybridization,sequencingandinvitroamplificationofDNA.NucleicAcidsRes,1989,17:
8543-8551.