PCR擴增產物的克隆——平端連接法

平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3'→5'外切酶活性和5'→3'的聚合酶活性）。

如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5'→3'校對能力，擴增出來的PCR產物已經是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。

這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。

對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X-gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

模板DNA

SauIKlenow片段T4連接酶

移液器移液器吸頭PCR小管DNA擴增儀電泳槽電泳儀臺式高速離心機

一、PCR反應

1.  依次混勻下列試劑

（1）H₂O：35 ul

（2）10×PCR反應緩沖液：5 ul

（3）25 mmol/L MgCl₂：4 ul

（4） 4種dNTP：4 ul

（5）上游引物（引物1）：0.5 ul
 

（6）下游引物（引物2）：0.5ul

（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 ul

（8）混勻后離心5秒。

2.  將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5  ul 約2.5 U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。

3.  用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環35輪，進行PCR。最后一輪循環結束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應產物擴增充分。

二、電泳

取10  ul 擴增產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應產物及長度。

三、PCR產物的純化

擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產物純化。

1.  酚/氯仿法

（1）取反應產物加100  ul TE。

（2）加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。

（3）再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。

（4）在水相中加300  ul 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。

（5）在小離心機上10000 rpm離心10 min，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH₂O 中，待用。

2.  Wizard PCR DNA純化系統

Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。 該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。

（1）吸取PCR反應液水相放于1.5 ml eppendorf管中。

（2）加100 ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。

（3）加1 ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內渦旋混合3次。

（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱。

（5）將注射器與微型柱分開，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2 ml 80%異丙醇，對微型柱進行清洗。

（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。

（7）將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50  ul TE或水，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒。

（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。

四、載體加dT尾

1.  將1 ug pUC19用SmaⅠ全酶切。

2.  在小管中按上述PCR反應，加入各種混合物，除將4 ul 4種dNTP改為4 ul 25 mM dTTP。

3.  加入1 ul(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。

4.  按前面三中所述，用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。

5.  加入2倍體積 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。

6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR產物與載體粘末端連接

1.  在7 ml PCR產物中加1 ml帶dT尾的pUC質粒。

2.  加1 ml T4DNA連接酶，1 ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過夜。

3.  取5 ml連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。

六、PCR產物3'突出端切平及平末端連接

1.  在50 ml的PCR產物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻。

2.  37℃反應10分鐘后，70℃滅活10分鐘。

3.  用酚:氯仿抽提2次。

4.  乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH₂O中。

5.  質粒用Smal 切開后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1 ml （約0.1 mg）加入上述PCR產物中。加T4 DNA連接酶1 ml ，連接緩沖液1 ml 。

6.  取5 ml 連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。

1.  PCR反應液可直接用于連接，但最好對PCR產物純化后進行連接，既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產物。

2.  PCR非常靈敏， 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。

3.  吸頭、離心管應高壓滅菌， 每次吸頭用畢應更換， 不要互相污染試劑。

4.  加試劑前， 應短促離心10秒鐘， 然后再打開管蓋， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。

5.  應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。

6.  純化樹脂在使用前必須充分混勻。

7.  PCR產物中礦物油應盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產量。

一、 PCR反應中的主要成份

1.  引物
 

PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：

（1） 引物長度約為16-30 bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。

（2）引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

（3）四種堿基應隨機分布，在3'端不存在連續3個G或C，因這樣易導致錯誤引發。

（4）引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應， 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。

（5）在引物內， 尤其在3'端應不存在二級結構。

（6）兩引物之間尤其在3'端不能互補， 以防出現引物二聚體， 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性。

（7）引物5'端對擴增特異性影響不大， 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。

（8）引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構， 以免產生非特異性擴增，影響產量。

（9）簡并引物應選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。

（10）一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0 umol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體， 過低則降低產量。利用紫外分光光度計， 可精確計算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計算：

X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個數。

2.  4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)

（1）dNTP應用NaOH 將pH調至7.0，并用分光光度計測定其準確濃度。

（2）dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200 umol/L。

（3）理論上4 種 dNTP各20 umol/L，足以在100 ul 反應中合成2.6 ug的DNA。當dNTP終濃度大于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。

3.  Mg²⁺

（1）Mg²⁺濃度對Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度， 影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。

（2）通常Mg²⁺ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一種新的PCR反應，可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg²⁺ 進行預備實驗，選出最適的Mg²⁺濃度。

（3）在PCR反應混合物中， 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團， 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg²⁺ 離子濃度的物質，以保證最適Mg²⁺ 濃度。

4.  模板

（1）PCR反應必須以DNA為模板進行擴增， 模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環狀分子(線狀分子比環狀分子的擴增效果稍好)。

（2）就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數量和純度.一般反應中的模板數量為102 -105 個拷貝，對于單拷貝基因，這需要0.1 ug的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時，用量更少。

（3）靈敏的PCR可從一個細胞，一根頭發，一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。

（4）模板量過多則可能增加非特異性產物。DNA中的雜質也會影響PCR的效率。

5.  Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。現在人們又發現許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。

Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30 min，摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般PCR中出錯率為2x 10-4 核苷酸/每輪循環，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應注意.在100 ul PCR反應中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環。

所用的酶量可根據DNA、引物及其它因素的變化進行適當的增減.酶量過多會使產物非特異性增加，過少則使產量降低。

反應結束后，如果需要利用這些產物進行下一步實驗，需要預先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：

（1）PCR產物經酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。

（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg²⁺ 。

（3） 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產物的Kit可用。

6.  反應緩沖液

（1）反應緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg^₂₊ 。Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8，但在實際PCR反應中，pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。

（2）反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 ug/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利。

（3）各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。