PCR擴增產物的克隆技術2

T－載體的構建

一：儀器：同質粒DNA提取實驗、酶切實驗及RT－PCR實驗

二：試劑：SmaI、其余同質粒DNA提取實驗、酶切實驗及RT－PCR實驗

三：操作：

1：提純載體DNA

2：將1ug提純的PGEMDNA用SmaI1ul進行全酶切（為了切割徹底、甚至能破壞酶切位點周圍堿基序列而防止自連發生，酶可過量使用，并在25℃過夜）

2：酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌，真空干燥復溶

3：在上述酶切反應后復溶的含1ugDNA的Eppendof管中加入

10× PCR緩沖液 5ul

10mM dTTP 10ul

1mg/mlBSA 10ul

5U/ul Taq酶 0.5ul

加水至50ul

70℃2小時，酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌，真空干燥復溶

此載體即可直接用于PCR產物的克隆。

PCR產物的T－載體克隆

一：儀器

同連接、轉化實驗

二：試劑

T－載體，其余同連接、轉化實驗

三：操作：

1:PCR產物的純化見上

2：PCR產物的克隆用自制或購置的T－載體按下述比例進行連接反應

反應體系 陰性對照體系 背景對照體系

10×T4DNA連接酶緩沖液 1 1 1

T－載體1 1 1

PCR產物 X(計算見附) 0 0

陰性對照DNA（500bp 4ng/ul ） 0 2 0

T4DNA連接酶（3u/ul） 1 1 1

加水至10ul

3：4℃過夜

4：T－載體與外源片斷連接后的轉化見實驗二二與二三
附：連接反應中PCR產物用量的確定

1：待重組片斷與載體間的最佳分子比

T載體與待克隆的對照DNA間的最佳分子比為1:1。一般分子比從1:8到8:1都是適合的。如果在實驗開始前,沒有確定載體與待克隆片斷間的最佳分子比,那么有必要在實驗時將最佳比給確定下來。3:1-1:3的比值在大多數情況下都能得到較好的實驗結果。PCR擴增后的片斷其濃度在實驗時也必須確定,確定其濃度的方法為或通過凝膠電泳后對待測片斷與一系列成梯度的已知濃度的DNA相比較而確定,或可通過比色法確定。

2：連接反應中待擴增片斷的用量可通過下列公式計算

X=A×B×D/C

a=載體的ng數、b=待克隆片斷的堿基數Kb、c=載體堿基數Kb

d=待克隆片斷與載體分子比（根據附1確定）、x=連接反應中待擴增片斷的用量

3用pGEMR-T系列載體系統生成單鏈DNA方法

要誘導單鏈DNA的生成,應用特定的輔助嗜菌體去感染含pGEMR-T或pGEMR-T Easy載體的菌體。質粒進入f1嗜菌體的復制區,使得單鏈DNA象存在于包裝蛋白內的病毒顆粒一樣被分泌出來。這種單鏈DNA很容易通過沉淀和抽提方法加以提取和純化。

注：1：在室溫下,縮短保溫時間,也可能是有效的操作方法,但這有可能降低克隆數。最適的連接條件為4℃過夜，因PCR產物與T－載體間的配對堿基少，高溫不利于連接的進行。經驗表明如連接反應高于15℃，則蘭斑數大大升高，可能T載體中存在沒有加上T的載體，高溫下平端自連的比例增加。

2：連接酶最好用相關的經修飾純化的T4DNA連接酶,因其他連接酶可能具核酸外切酶的活性,這樣如用這種酶就有可能導致對載體3’T產生切割。

3：T4DAN連接酶的10×緩沖液中含ATP,在溫度頻繁波動時,此成分有可能被降解,因此要避免僅為了少量使用而對緩沖液反復凍融。如果在融化后的T4DAN連接酶10×緩沖液中出現沉淀,則應將此緩沖液振蕩,以使沉淀復融。

4：重組T載體轉化時最好用SOC培養基,LB培養基也能用,但轉化數可能低。

5：因含β半乳糖苷酶的菌落生長速度慢于無此酶活的菌落,因此保溫過夜后,藍斑菌落要遠小于白斑菌落,白斑菌落的直徑近1毫米。

PCR產物的平端克隆

儀器：同上

試劑：SauI,Klenow片段,T4連接酶

操作：載體提取后用過量SmaI切割，提取、純化

PCR反應液加熱到99℃10 min，滅活Taq酶，補鎂離子到5-10mM加入1u Klenow片段，70℃15min。純化

載體與PCR產物以1：10比例16℃連接過夜

PCR反應液可直接用于連接，但最好對PCR產物純化后進行連接，既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產物。