PCR擴增產物的檢測分析

PCR擴增反應完成之后，必須通過嚴格的鑒定，才能確定是否真正得到了準確可靠的預期特定擴增產物。凝膠電泳是檢測PCR產物常用和最簡便的方法，能判斷產物的大小，有助于產物的鑒定。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用來檢測小片段DNA。

1．瓊脂糖凝膠電泳

這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。
用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

（1）制膠

瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來，過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml，稱取瓊脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波爐加熱2-5min，使瓊脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時，加入終濃度0.5μg/ml的EB液，充分混勻后倒板（注意排除氣體）。

（2）加樣和電泳

上樣時一般取PCR反應液5~10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源，使樣品由負極向正極移動。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。

（3）檢測

將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測，DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現，并與擴增時所設的陽性對照比較，判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照，判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣，但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

它與瓊脂糖凝膠電泳比較具有如下優點：

①分辨率很強，可達1bp；

②能裝載的DNA量大，達每孔10μgDNA；

③回收的DNA純度高；

④其銀染法的靈敏度較瓊脂糖中EB染色法高2~5倍；

⑤避免了EB迅速退色的弱點，銀染的凝膠干燥后可長期保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍：

(1)制膠

在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

制備適量合適濃度的凝膠，使之略多于膠板。制備100μl體積凝膠的配制方法見下表。

不同濃度（%）聚丙酰胺凝膠的制法：

在加入TEMED和10%過硫酸銨后，立即混勻，倒入放置45℃角的玻璃板內，完全注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊，待30-60分鐘膠聚合后，取下膠板，放入電泳槽中固定。

（2）加樣和電泳

上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過加樣孔，拔出梳子，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻，用微量注射器加入加樣孔底部，使樣品在孔底成一層，兩側孔中加入標準分子量的DNA Marker。

以2-10V/cm電壓電泳，電泳時間足夠長，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時關閉電源，將膠片取出。

（3）銀染

分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min，雙蒸水洗3次，每次2min，然后將凝膠片轉入100ml 0.2%的AgNO₃中于搖床上染色約10min，吸去AgNO₃液，用雙蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時，吸去顯色液，加入固定液Na₂CO₃，靜置2-3min，取出凝膠觀察。