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  • 發布時間:2020-09-07 12:33 原文鏈接: PCR擴增產物的電泳分析1

    凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。
    一、瓊脂糖凝膠電泳
    瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法。瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物。根據瓊脂糖的溶解溫度,把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖。低熔點瓊脂糖熔點為62~65℃,溶解后在 37℃下維持液體狀態約數小時,主要用于DNA片段的回收,質粒與外源性DNA的快速連接等。
    1、凝膠濃度
    凝膠濃度的選擇依DNA分子的大小而定。

    瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍。

    瓊脂糖濃度(%) 線型DNA分子的分離范圍(Kb)
    0.3 5~60
    0.6 1~20
    0.7 0.8~10
    0.9 0.5~7
    1.2 0.9~6
    1.5 0.2~3
    12.0 0.1~2

    2、電泳緩沖液

    核酸電泳緩沖液有三種,即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE)。TBE 與TPE緩沖容量高,DNA分離效果好,但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高,容易使DNA沉淀。TAE緩沖容量低,但價格較便宜,因而推薦選用 TBE.緩沖液中的EDTA可螯合 二價陽離子,從而抑制DNA酶的活性,防止PCR擴增產物降解。
    10XTBE緩沖液的配制:Tris鹼,108克 EDTA,9.3克 硼酸,55克 H2O至,1000ul (其PH應為8.0~8.2) 臨用時用水稀至0.5XTBE(20倍稀釋。
    3、核酸電泳的指示劑與染色劑
    1)指示劑:核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色。
    溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色,在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中,溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。
    二甲苯青的水溶液呈蘭色,它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時,其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。
    指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液。載樣緩沖液的作用有①增加樣品密度,使其比重增加,以確保DNA均勻沉入加樣孔內。②在電泳中形成肉眼可見的指示帶,可預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色,使加樣操作更方便。


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