PCR擴增產物的鑒定

實驗概要

PCR擴增產物可以通過酶切分析、凝膠電泳（瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺電泳、毛細管電泳等）、Southern雜交、克隆、測序等方法分析，電泳前還可以應用紫外分光光度計定量DNA。當采用凝膠電泳時也有溴化乙錠顯色、銀染法、熒光顯色等不同的顯色方法。本實驗室采用的是非變性連續緩沖系統聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳及硝酸銀顯色分型方法。

實驗原理

生物大分子如蛋白質、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中．它們的凈電荷取決于介質的H   濃度或與其他大分子的相互作用。在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移．遷移的方向取決于它們帶電的符號．這種遷移現象即謂電泳。遷移的方式目前可以根據分子尺寸大小、分子所帶的電荷或分子的生物學與化學特性分為三類。如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有一定遷移速率的驅動力來自于顆粒的有效電荷Q和電位梯度E。它們與介質的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，這種抗衡服從斯托克斯定律。f=6πrvη   這里v是在介質粘度為η半徑為r的顆粒的移動速度。但在凝膠中，這種抗衡并不完全符合斯托克斯定律。f還取決于介質小的其他因子，如凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至介質的內滲率等。簡言之電泳就是帶電顆粒在電場中定向移動。
銀染顯色的原理是用甲醛將沉積在DNA帶上的銀離子（硝酸銀）還原成金屬銀而顯帶。

主要試劑

1. 聚丙烯酰胺（C=30% T=5%）：丙烯酰胺 28.5g 、 N，N’-二甲基雙丙烯酰胺 1.5g、DDH₂O 100ml；

2. 7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺 23.3ml、10ml 10×TBE溶液、66.7ml DDH₂O；

3. 10×TBE溶液：Tris 113g 、硼酸 55g、 1000ml DDH₂O；

4. 1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900ml DDH₂O；

5. 10%乙醇；

6. 0.1%硝酸；

7. 0.2%AgNO₃：

8. AgNO₃ 0.15g、DH₂O 225ml；

9. 30%NaCO₃-甲醛：NaCO₃ 30g、甲醛 0.85ml；

10. 0.1% AgNO₃：AgNO₃ 1g、1000ml DH₂O；

11. 上樣緩沖液：0.25％二甲苯氰藍、0.25％溴酚藍；

12. TEMED；

13. 10％過硫酸胺：過硫酸胺1g、10ml DDH₂O。

主要設備

1. 垂直電泳儀

2. 垂直電泳槽

3. 玻璃

4. 橡膠模框

5. 點樣梳

6. 搖床

7. 微量進樣器

8. 染色托盤

實驗材料

PCR擴增產物

實驗步驟

1. 電泳槽玻璃板的處理：用洗滌劑清洗玻璃板，自來水反復沖凈洗滌劑，雙蒸水沖洗3次，烘干，將兩塊玻璃裝入恰當德橡膠模框內，并組裝好電泳槽（帶長玻璃的貯液槽為正極，帶短玻璃的貯液槽為陰極）。
2.  制膠：加 35μl  TEMED和300μl2.5％過硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混勻。以60O角，緩慢注入兩玻璃板間的空隙中，直至灌滿模具頂部。立即插入相應的點樣梳，（小心勿使梳齒下帶進氣泡，并且不要將梳齒全部插入膠內，留約2mm梳齒于玻璃板上端，以免拔梳時把膠孔拔斷）。由于凝膠在聚合過程中有回縮，所以應小心添加些膠液于梳子處，水平放置，室溫聚合1小時。向電泳槽內灌入  1×TBE電泳緩沖液。小心取出點樣梳，用槽內的緩沖液反復沖洗點樣孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
3. 加樣：取2-4μl擴增產物和2μl上樣緩沖液混勻,用微量進樣器小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可適當增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。
4. 電泳：電泳槽接上電極開啟電源，根據擴增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小，決定電泳的電壓及電泳時間。通常室溫下以l～5V／cm電泳。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約50px時,停止電泳。
5. 銀染法顯色：
   1) 方法一：

      a. 將PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用純水洗一次；
      b. 0.1%硝酸3min，蒸餾水洗兩次。
      c. 0.2% AgNO₃溶液中10min，用去離子水洗三次；
      d. 用30% NaCO₃-甲醛溶液顯色至滿意為止，用適量10%冰乙酸終止顯色。
   2) 方法二：

      a. 取下凝膠，蒸餾水清洗凝膠30秒；

      b. 0.1% 硝酸銀染色10分鐘；

      c. 棄去染色液，蒸餾水洗膠兩次；

      d. 顯色液（顯色液配方：10g NaOH 0.2g Na₂CO₃ 2ml甲醛溶液，定溶到 500ml）顯色至滿意為止。
6. 分型：參照基因階梯的電泳譜帶進行分型。

注意事項

1. 每加完一個樣品要清洗微量進樣器,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
2. 以二甲苯氰藍和溴酚藍的位置大致判斷泳動距離，7％聚丙烯酰胺非變性膠中溴酚藍相當于170bp的泳動距離，二甲苯氰藍相當于40bp的泳動距離。
3. 銀染時顯色液配制好在4-10 ℃預冷可以減輕膠板的底色，銀染后膠板在水中漂洗時間控制在10s以內。