| 實驗材料 | |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 |
一、目的
了解多聚合酶鏈反應DNA 擴增技術的基本原理和實驗應用，掌握PCR反應基本技術。
二、原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應是1986 年由Kallis Mullis 發現。這項技術已廣泛地應用于分子生物學各個領域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機制探查，法醫鑒定等方面。 PCR技術已成為方法學上的一次革命，它必將大大推動分子生物學各學科的研究發展。
PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側的寡核苷酸引物經酶促合成特異的DNA 片段的體外方法，由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應組成一個循環，然后反復進行，使目的的DNA 得以迅速擴增。置待擴增DNA 于高溫下解鏈成為單鏈DNA 模板；人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側的兩條鏈互補結合；DNA聚合酶在72℃將單核苷酸從引物3'端開始摻入，沿模板5'— 3'方向延伸，合成DNA 新鏈。由于每一循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板，所以PCR 產物以指數方式增加，經25—30次周期之后，理論上可增加109倍，實際上可增加107倍。
PCR 技術具有操作簡便、省時、靈敏度高特異性強和對原始材料質量要求低等優點，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能糾正反應中發生的錯誤核苷酸摻入，估計每9000個核苷酸會導致一個摻入錯誤，不過Innis M·A 發現，錯誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯誤不會擴大。
PCR 技術應用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實驗，但本實驗所介紹的方法可適應于大多數DNA 擴增反應，即使有的不適應，至少也確定了一個共同的起點，在此基礎上可以作多種變化。不過下列因素在實驗應用時應予以特別注意，以求取得滿意結果。
1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴增樣品質量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結合DNA 的蛋白質。
2、引物：引物是決定PCR 結果的關鍵，下列原則有助于引物的合理設計。
（1）盡可能選擇堿基隨機分布，GC 含量類似于被擴增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。
（2 ）避免具有明顯二級結構（尤其是在引物3'—末端）的序列。
（3 ）防止引物間的互補，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。
（4）引物的長度約為20個堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。
（5）引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體，而且擴增微量靶目標或起始材料是粗制品，容易產生非特異產物。