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  • 發布時間:2020-04-27 19:49 原文鏈接: PCR擴增的原理和操作步驟有哪些

      PCR技術的基本原理 類似于DNA的 天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

      PCR是一種體外DNA 擴增技術,是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴于DNA聚合酶的酶促合反應,將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經“高溫變性——低溫退火——引物

      PCR擴增儀

      延伸”三步反應的多次循環,使DNA片段在數量上呈指數增加,從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。

      在環境檢測中,靶核酸序列往往存在于—個復雜的混合物如細胞提取液中,且含量很低,對于探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因,雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級,再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用, 如RT-PCR、競爭PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。

       到如今,PCR方法愈發趨向自動化,并從中衍生出更多的新技術方法,可以說,PCR技術是支撐現代分子生物學發展的一塊重要基石。這種技術的廣泛應用催生了一個龐大的市場,多個公司均有各種類型的商品化PCR儀出售。

       PCR原理:DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶的作用下,以單鏈為模版,根據堿基互補配對原則復制成新的單鏈,與模版配對成為雙鏈分子拷貝。在體外實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設計與模板DNA的5’端結合的兩條引物,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,多次重復“變性解鏈-退火-合成延伸”的循環就可以以幾何級數大量擴增特定的基因。而發現耐熱DNA聚合酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。

       從PCR原理可以看出,PCR儀的關鍵是升降溫的步驟。現在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實驗如何在3個水浴鍋中完成的趣聞。經過不斷改進,今天的PCR已經越來越完善和智能化。


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