PCR擴增在擴增DNA產物末端引入限制性核酸內切酶酶切位點

噬菌體 T4 DNA 連接酶 限制性內切核酸酶 靶 DNA

氯仿 EDTA 乙醇 酚 氯仿 乙酸鈉 TE

瓊脂糖凝膠 水浴箱

一、材料

1. 緩沖液與溶液

氯仿

EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)

TE ( pH 7.5)

2. 酶與緩沖液

噬菌體 T4 DNA 連接酶

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠

4. 核酸與寡核苷酸

正向引物（20 μmol/L）與反向引物（20 μmol/L）溶于水中

靶 DNA

5. 載體

質粒 DNA 應用相應的限制性內切核酸酶消化和凝膠電泳純化

6. 特殊設備

水浴箱

二、方法

1. 應用本方案的材料部分設計的正向與反向引物，分成 4 支相同的 50 μl 體積反應管進行 PCR 反應擴增靶片段。合并 4 個反應管的反應液，溶液中應含有 200~500 ng 的期望的擴增產物。

2. 如果 PCR 產物電泳檢査含有多于一或兩條擴增 DNA 條帶，可通過低融點瓊脂糖凝膠純化擴增片段。如果不用凝膠電泳純化，制備的 PCR 擴增 DNA 可用酚: 氯仿抽提，和 Cemricon-100 濃縮器超濾純化。純化后的擴增產物溶于 TE 中（pH 7.5)，濃度為 25 μg/ml。

3. 取約 100 ng 純化后的 PCR 產物，在 20 μl 酶切反應體系中加入 1.0~2.0 單位的相應限制性內切核酸酶進行酶切消化。將反應液孵育在最適溫度消化 1 h。

4. 消化結束后，用 H₂O 調整反應混合液至 10 μl，加入 0.5 mol/L EDTA 至終濃度為 0.5 mol/L。將反應液用酚: 氯仿與氯仿各抽提一次。

5. 轉移反應液上層水相至一個新的離心管中，加入 3 moI/L 乙酸鈉（pH 5.2) 至終濃度為 0.3 mol/L，加入 2 倍體積的乙醇，在 0℃ 貯存 30 min。

6. 將離心管放置在微量離心機上 4℃ 高速離心 5 min，使 DNA 沉淀，棄上淸，然后用 70% 乙醇洗滌沉淀，溶液再離心，棄上清，將 DNA 沉淀物在空氣中晾干數分鐘。

7. 將 DNA 樣品溶于 10 μl 水中。

8. 在一只微量離心管內，依次加入下列試劑，混合：

25 μg/ml 擴增靶 DNA                  1.0 μl

質粒 DNA                                   20 ng

10X 連接緩沖液                           1.0 μl

T4 DNA 連接酶                           1 單位

用 H₂O 調整終反應體積為 10 μl 反應體系。

如果需要，可加入 ATP 至終濃度 1 mmol/L。

在定向克隆的連接反應液中，純化后靶 DNA 與酶切后的質粒載體的摩爾比例應為 1:1。設置對照反應管，加入以上除了質粒 DNA 的所有試劑。

9. 將連接反應混合液試管在 16°C 水浴溫育 4 h。

10. 將上述二支試管內的連接反應液樣品各取 5 μl，用 10 μl 水稀釋后，轉化具有抗生素抗性的感受態大腸桿菌受體菌。將這種轉化菌液涂布于含合適抗生素和 IPTG 與 X-gal 的培養基的平皿上。

11. 計算實驗管與對照管在培養皿上的菌落數。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片斷的白色菌落進行培養擴增，抽提質粒 DNA，利用質粒多克隆位點內的插入外源 DNA 片段側翼的酶切位點，用相應的限制性內切核酸酶進行酶切鑒定，也可以用菌落 PCR 予以鑒定。

在不同的實驗中，藍白斑的比例在 1:5 與 2:1 之間變動。

12. 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定克隆 DNA 片段的大小 （利用適合的 DNA marker 分子量作對照）。

13. 利用 DNA 序列分析，限制性內切核酸酶圖譜或 Southern 雜交進一步鑒定克隆的靶基因 DNA 片段的正確性。