PCR擴增樣本DNA的HLA基因片段

一、PCR擴增體系

1. 1.0uM 引物

2. 300ng待測樣本基因組DNA

3. 2.0U Taq多聚酶

4. 200uM 各種dNTP

5. 用1 X PCR緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%明膠）調至總體積100ul，并用50ul礦物油覆蓋，防止水分蒸發。

二、PCR擴增程序

按下列條件擴增30個循環，此程序適用于Perkin-Elmer9600擴增儀，其他型號擴增儀也可以參考。

1. 檢測DR3、5、6、8

預變性：94℃，5分鐘
      變性：  94℃，30秒
      退火：  60℃，50秒
      延伸：  72，℃40秒

2. 檢測DR2

預變性：94℃，5分鐘
      變性：  94℃，30秒
      退火：  62℃，50秒
      延伸：  72℃，40秒

3. 檢測DR1

預變性：94℃，5分鐘
      變性：  94℃，30秒
      退火：  55℃，50秒
      延伸：  72℃，40秒

三、PCR擴增產物的鑒定

此步驟是監測PCR擴增的結果，預先用2%瓊脂糖和1 X TBE制備凝膠，每100ml凝膠中加入10ul溴化乙錠（10mg/ml），用梳子形成約10ul的加樣孔，讓凝膠完全凝固。

1. PCR擴增完畢后，吸取10ul的PCR反應液，置另一擴增管中；

2. 加入1～2ul的加樣緩沖液（4%蔗糖，0.05%溴酚藍）；

3. 20V/cm電泳；

4. 溴酚藍移動7cm后停止電泳

5. 在紫外投射光下觀察電泳結果并拍照。

PCR擴增后，電泳凝膠上應出現相應的PCR擴增產物條帶。