如果構建Fab抗體庫,必需利用RT-PCR獲取抗體基因;構建ScFv抗體庫,既可以DNA作模板,也可以cDNA作模板。本室在構建小鼠ScFv抗體庫過程中,主要采用DNA作為擴增模板。
【材料和試劑】
（1）PCR儀
（2）Taq酶
（3）氯仿
（4）瓊脂糖
【操作步驟】
（1）在200μl離心管中混勻下列成分：
模板DNA 5μg
10×PCR緩沖液 10μl(含25mmol/L MgCl2)
5’引物 20pmol
3’引物 20pmol
Taq酶 5U,加超純水至100μl,石蠟油1滴。
（2）93℃預變性2min,然后94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,反應進行30個循環后,再72℃延伸10min；
（3）將反應物冷卻至室溫，用等體積氯仿抽提去掉石蠟油,水相轉移到一個干凈的離心管中,取5μl在1.5％的瓊脂凝膠上電泳，觀察擴增產物大小,重鏈產物在370～390bp左右,輕鏈產物在340～360bp之間。
（4）利用PAGE或瓊脂糖凝膠電泳回收合適大小的DNA條帶。當采用瓊脂糖凝膠電泳回收時,不能使用Bio101公司的Geneclean Kit回收,該產品只適于回收大于500bp的DNA片段。而Promega公司的WizardTM PCR純化kit的回收效率在80％以上。
在PCR擴增中要將5’端引物與3’端引物逐一配對,工作量較大。采用混合引物或簡并引物擴增可以減少配對擴增的數目,但效果并不總是十分理想。