PCR常見問題
一.沒有擴增產物
1.循環溫度：變性溫度、退火溫度
2.引物設計
3.DNA聚合酶活性
4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份)
5、DNA樣品
二.非特異產物及電泳呈涂布狀
1.Mg2 濃度
2.調整引物、模板、聚合酶的用量
3.適當減少循環數
4.適當提高退火溫度，縮短退火或延伸時間
?三.引物二聚體的形成
1.檢查引物的序列
2.提高退火溫度
3.調整引物與模板濃度
4.增加引物長度
? 四.假陽性結果的預防
1、實驗器材應一次性使用(吸咀、PCR管)
2、注意操作環境，戴一次性手套
3、嚴格PCR操作規程
4、多次取樣的試劑應分裝
5、設置陰性對照和陽性對照
PCR相關技術
一.錨定PCR(anchored PCR)：
?引進錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。
?在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對應的錨定引物poly(dC)一般應在十二聚以上。
二.不對稱PCR(asymmetric PCR)
不對稱PCR主要是在PCR體系中設計不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個循環兩條模板等量擴增，之后低濃度引物消耗殆盡，其擴增產物減少以至于無；而高濃度引物介導產生的擴增產物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測序。
三.反向PCR(inverse PCR)
四.多重PCR(multiplex PCR)
多重PCR是用多對引物同時對模板DNA上的多個區域進行擴增。
多重PCR技術的難點不是在于其原理和操作的復雜性，而是在于其多對引物的設計，必需保證多對引物之間不形成引物二聚體，引物與目標模板區域具有高度特異性。
應用于基因診斷，對與疾病相關的基因（龐大）進行擴增檢測。
五.逆轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)
?由mRNA逆轉錄產生cDNA鏈作為PCR反應模板。
?逆轉錄合成cDNA時，引物可選用特異引物、隨機六聚體引物或寡聚dT(12-18)。
?設計RT-PCR的引物時最好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導致假陽性結果
六.差別PCR(differential PCR)
差別PCR是將靶基因與已知拷貝的參照基因置于同一PCR反應體系中，用同一套引物進行擴增，電泳染色后可根據參照基因的擴增產物與待測基因擴增產物的相對豐度對待測基因進行定量。
七.原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在組織或細胞標本片上直接進行PCR，對細胞中的靶DNA進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。可分為直接法和間接法。
基本步驟：組織切片或細胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴增→沖洗→產物檢測
優點：靈敏度高，可進行細胞內定位
八.熒光定量PCR(FQ-PCR)
熒光定量PCR：融匯PCR技術、DNA探針雜交技術(標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團)，結合先進的光譜檢測技術發展起來的一項新技術。
主要原理是在待擴增區域結合上DNA探針，PCR過程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物鏈到DNA探針時，將DNA探針逐個降解，釋放出熒光報告基團，這樣PCR體系中熒光的強度與PCR產物量之間存在正比關系，可通過測定熒光強度而對PCR產物定量。
?熒光定量PCR的優點：
?1.可進行準確的定量檢測。用于基因診斷。
?2.定量范圍寬。
?3.特異性更強，克服了假陽性。
?4.操作簡單快速，無須后處理和電泳檢測。
?5.安全，技術易于學習，易于進行電腦化數據管理。
PCR技術的應用
1.遺傳性疾病的基因診斷
2.傳染病的診斷(肝炎病毒)
3.癌基因檢測
4.法醫學(親子鑒定)上的應用
5.DNA測序
6.基因克隆
7.引入基因點突變,基因融合等
