PCR技術原理、實驗步驟和應用

一、實驗目的

1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術。

二、實驗原理

PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、實驗試劑與器材

模板DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR儀、移液槍、PCR板

四、實驗步驟

1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

模板DNA    2μL

引物1      1μL

引物2      1μL

dNTP      1.5μL

MgCl2        2μL

10×buffer    2μL

ddH2O      10μL

Taq酶      0.5μL

2、設置PCR反應程序。

3、上樣，啟動反應程序。

4、擴增產物的電泳檢測。

附PCR技術應用

1、生命科學 a、人類基因組計劃 隨著的PCR日臻完善，科學家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎上，經過整理、分類和排列后得到的更加準確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的首次揭示，表明科學家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊涵的內容。 b、后基因組計劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態性及其單倍型以及尋找其在生物和醫學應用中重要成為人們關心的熱點。以研究基因功能為核心的“后基因組時代”已經來臨，大規模的結構基因組、蛋白質組以及藥物基因組的研究計劃已經成為新的熱點。 c、物種的分類、進化及親緣關系 可以進行物種進化的保守性分析及物種多態性分析、物種鑒定。

2、醫藥 a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾病：如地中海貧血、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分，均可預測；癌基因的檢測和診斷：檢測惡性腫瘤的標記物來診斷癌癥等疾病；利用基因治療方法治療腫瘤性疾病。 b、致病病原體的檢測 檢測范圍包括細菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物。檢測的靈敏度和特異性都遠高于當前的免疫學方法，所需時間也已達到臨床要求，這對于難于培養的病毒（乙肝），細菌（如結核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。 c、DNA指紋、個體識別（DNA身份證）、親子關系鑒別和法醫物證 可以用一根頭發、一個細胞、一個精子來完成上述工作，這一領域也已發展到骨髓或臟器移植配型。 d、生物工程制藥 許多藥物可通過工程菌和細胞來大量生產，如干擾素、白介素、促紅細胞生長素等藥物。 e、轉基因動物制藥及疾病模型 轉基因動物與醫學及生物醫藥研究的關系越來越密切。近年來,各種人類疾病轉基因動物模型不斷建立。如轉基因動物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫學、藥理學研究中的應用；利用轉基因動物-乳腺生物反應器生產藥物蛋白,好比在動物身上建“藥廠”,可以從動物乳汁中源源不斷地獲得具有穩定生物活性的基因產品。這是一種全新的藥物生產模式,具有投資成本低,藥物研制周期短和經濟效益高等優點。

3、農業科學 a、轉基因植物 按其功能主要分提高產量、抗病力、抗除草劑、改良品質和發育調節。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。 b、轉基因動物 在農業方面，主要在改良畜禽生產性狀,提高畜禽抗病力及利用轉基因畜禽生產非常規畜產品。

4、考古學及歷史事件解讀利用人類短串聯重復STR-PCR技術，研究人類種族的遺傳多態性，效果非常穩定。目前此技術已廣泛用于生物考古、種系發育、民族學、人類學和考古學等各個領域中。

5、衛生安全 a、食品微生物的檢測 傳統的致病菌檢測首先經過長時間的培養，費時費力，應用PCR技術則非常迅速、準確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測；水中細菌指標測定。 b、轉基因食品的檢測 目前世界轉基因食品已經有100多物種，大多數已經用于食品。轉基因食品對人體健康的危害及對生態的影響也日受世界廣泛的重視，因此對轉基因食品的檢測成為控制其泛濫的一種手段。 c、動、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進出口口岸的門衛，檢查出入國門的人員、動、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國門之外，是提高我國綜合國力的必要保證。