目前廣泛采用的 DNA 測序方法有化學法和雙脫氧法兩種,它們對模板的需要量比較大。利用 PCR 方法可以比較容易地測定位于兩個引物之間的序列。利用 PCR 測序有下列幾種方法。
(1)雙鏈直接測序
將 PCR 產物進行電泳回收或利用分子篩等方法除去小分子物質。采用熱變性或堿變性的方法使雙鏈 DNA 變成單鏈,與某一方向引物退火,在 PCR 系統中加入測序引物和4種中各有一種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)的底物,即可按 Sanger 的雙氧鏈終止法測定 DNA 序列。用這種方法測序時,一次測定的距離較短,同時容易出現假帶。
(2)雙鏈克隆后測序
為避免雙鏈直接測序的缺點,可以將 PCR 擴增產物直接克隆到 M13載體中,通過提取單鏈后進行序列測定。
(3)基因擴增轉錄序列
在 PCR 時,使用一個5'端帶有 T7 啟動子的序列,擴增后在 T7 RNA 酶作用下合成 mRNA 作為模板,可逆轉錄酶測序。
(4)不對稱 PCR 產生單鏈測序
在 PCR 反應中加入不等量的一對引物,經過若干循環后,其中一種引物被消耗盡,在隨后的循環里,只有一種引物參與反應,結果合成了單鏈。